镉毒害对二倍体小麦的影响及镉响应的分子机制

Qiao K, Liang S, Wang F, Wang H, Hu Z, Chai T. Effects of cadmium toxicity on diploid wheat (Triticum urartu) and the molecular mechanism of the cadmium response[J]. Journal of hazardous materials, 2019, 374: 1-10.

摘自美吉生物论坛http://interact.majorbio.com/article/detail/470

期 刊 名：Journal of hazardous materials 发表时间：2019.04 IF：7.91
作者单位：中国科学院大学
测序产品：真核有参转录组
样品来源：小麦

导语：随着现代农业技术的迅速发展，重金属污染物已成为全世界严重的环境问题。重金属镉（Cd）是一种非必需的微量元素，主要来源于污水污泥，农药，杀菌剂磷肥以及其他添加到土壤中的工农业产品。镉不易在土壤中迁移，因此镉污染难以解决。由于Cd是毒性最大的污染物之一，即使在较长时期内Cd浓度较低也会对作物产量和品质产生负面影响。环境中过量的Cd不仅严重影响谷类作物的生长发育，还会在植物组织中积累并进入食物链。镉是一种有效的蛋白酶抑制剂，即使低浓度的镉也会导致线粒体降解和有丝分裂中断。这可以抑制细胞增殖和分裂，最终导致肺气肿和骨质疏松症等疾病，以及对动物和人类的肺，肾和骨骼的损害。本研究有助于了解小麦镉的毒性及镉反应的分子机制。有助于通过育种鉴定降低镉污染的靶基因。有助于促进镉污染地区的植物生长和维持食品安全。

实验设计思路：

研究结果：

1.小麦芽和根中Cd的积累

随着镉处理时间的增加，小麦体内镉含量呈现上升趋势，但是在6天时略有下降，可能是由于小麦的自我保护导致，并且地上部分的镉含量远小于根系中镉的含量。

2.芽和根中Pro，MDA，H2O2和GSH的浓度

对照幼苗和用Cd处理2d的幼苗中的Pro含量没有显着差异，但是在Cd处理持续5天（p <0.01）Pro含量显着更高。 在根中，Cd处理2天后Pro含量显着高于对照（p <0.01），并且Cd处理5天的幼苗中Pro显示出最高水平（p <0.05）。芽和根中的MDA含量在未处理的幼苗和用Cd处理2和5天的幼苗之间没有显着差异。幼苗中的H2O2含量在对照和用Cd处理2和5天之间也没有显着差异。然而，用Cd处理5天的幼苗中的H2O2含量比对照的幼苗高约4倍（p <0.05）。对照的幼苗和用Cd处理2天的幼苗的芽和根的GSH含量没有显着差异，但在用Cd处理5天的幼苗中显着更高（p <0.01）。在用Cd处理5天的幼苗中，根中的GSH含量比未处理的幼苗高约10倍（p <0.05）。

3.芽和根的形态

在对照中，叶片和根的形态是正常的。叶尖具有完整且整合的细胞结构，并且覆盖有许多尖锐的表皮毛。根尖的伸长区具有规则排列的表皮细胞，根帽由薄壁细胞保护。在用Cd处理2天（C2）的幼苗中，根表皮细胞的结构受损，根表面没有显示细胞的规则排列，存在表皮分泌物，并且覆盖根冠的薄壁细胞较少。用Cd处理2天的幼苗叶尖未显示出损伤症状。Cd处理5天（C5）的幼苗中，叶尖上存在表皮分泌物，表明对枝条的轻微损伤。根尖的完整性严重受损，并且许多分泌物沉积在根表面上。根帽部分或完全塌陷并开始脱落。

4.确认RNA测序结果
为了确认RNA测序数据的可靠性，分别从WS对C5S和WR对C5R中选择20个DEGs，包括芽和根中的10 UR和10 UR。 RT-qPCR结果与RNA测序数据密切相关。对于每个基因，由转录组数据确定的表达水平与qPCR分析中获得的表达水平相似。证实了RNA测序和RT-qPCR之间产生的RNA测序数据的可靠性（R2 = 0.8501和0.9208）。

5.DEGs的分析

在幼苗中，用Cd处理2天的幼苗中有3个下调（DR）基因和11个上调（UR）基因，但是用Cd处理5天的幼苗中分别有1539和911个DR和UR基因。 在根中，在用Cd处理2天的幼苗中分别有101个DR和309个UR基因，并且在用Cd处理5天的幼苗中分别有大约10倍和4倍的DEG。Venn分析表明，在芽中，WS与C2S，WS与C5S和C2S与C5S分别为1、546和1324 DEGs。在根中，WR对C2R，WR对C5R和C2R对C5R分别为102、1146、680 DEGs。

6.主成分分析
所有样品组（WS，WR，C2S，C2R，C5S和C5R）具有三个重复的RNA-seq数据，并且每组在PCA输出中被不同颜色的椭圆形包围。与其他样品相比，三个样品的重复相互之间具有相对更密切的关系。 WS和WR组位于C2S和C2R组附近，远离C5S和C5R组，表明对照和2-Cd处理的样品之间的基因表达相似性高于对照和5-d Cd处理的样品之间的基因表达相似性。

7.GO和KEGG富集分析

GO富集分析表明子在幼苗中，分子功能类别中显着富集的是结合和催化活性，而生物过程类别中的是代谢和细胞过程。分子功能中被富集的通路有DNA结合，结合，杂环化合物结合和有机环状化合物结合。生物学过程GO术语包括细胞过程，DNA构象变化，染色质组装或拆解，DNA包装和蛋白质-DNA复合物组装。在根中，WR与CR被富集的通路有催化活性，氧化还原酶活性，四吡咯结合，血红素结合和金属离子结合，在分子功能类别中生物和代谢过程，氧化还原过程，单一生物代谢过程，对刺激的反应和单一生物过程在生物过程类别中。

进行KEGG分析以鉴定在Cd处理下的小麦中的富集途径。在幼苗中，真核生物中的核糖体生物发生，核糖体，DNA复制和碱基切除修复是显着富含DEG的途径。 DNA复制是WS与C5S中最重要的途径。在WS与C2S中没有显着富集途径，并且DNA复制途径是在WS与C5S和C2S与C5S中的DEG中富含的共同途径。在Cd胁迫下，编码增殖细胞核抗原（PCNA），解旋酶（Dna2），DNA聚合酶，微染色体维持蛋白（MCM）复合物和DNA连接酶的基因的表达水平均降低（参与DNA复制）。

在根中，苯丙烷类生物合成是唯一显着富含DEG的途径。在该途径中，4-香豆酸-CoA连接酶（4CL，EC 1.14.1311）的表达被下调。然而，松柏醛-醛脱氢酶（CALDH，EC 1.2.1.68）的表达被上调。其他基因包括苯丙氨酸氨裂解酶（PAL，EC 4.3.1.24），肉桂酰辅酶A还原酶（CCR，EC 1.2.1.44），肉桂醇脱氢酶（CAD，EC 1.1.1.195），β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21） ）和过氧化物酶（EC 1.11.1.7）均下调和上调。

8.结论

Cd处理导致芽和根中脯氨酸和谷胱甘肽含量增加，叶尖轻微损伤，根尖严重受损，根分泌物增加。转录组分析表明，Cd胁迫5 d后芽和根中的差异表达基因显著高于Cd胁迫2 d后芽与根的差异表达基因。KEGG分析表明，在Cd处理下富集的途径是“DNA复制”和“苯丙烷类生物合成”。

点评：

这篇文章中规中矩，没有可炫耀的实验技术，也没有做代谢通路的验证，居然发了7.9分的杂志！我分析有以下几个理由：

1. 有两个重要的组织（根、叶）；

2. 有时序分析（处理2天和5天）；

3. 有表型（Pro，MDA，H2O2和GSH等生理指标和显微观察）；

4. 测序可靠性实验充分（根、叶各挑选10对，共20次验证实验，相关系数0.85以上）；

5. 主成分分析显示样本间可靠性强，且与差异表达趋势一致（处理2天和对照表达相近，但与处理5天的差异显著）；

6. 对代谢通路即生理意义的描述详细，虽只是预测，但数据详实，与测序结果结合得好，附图也不错。

总起来说，这篇文章做得扎实，该有的都超额完成，让人感觉很舒服！虽然是植物领域，但具有普遍参考价值，对动物领域的人来说也很有启发。