H₂0₂传感器是拟南芥中的一种LRR受体激酶

标题：Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase

 in Arabidopsis

期刊：Nature（19 January 2020）

第一作者：吴飞华（博士）

通讯作者：Zhen-Ming Pei

通讯地址：杜克大学

DOI：10.1038/s41586-020-2032-3

一．研究背景

动物植物面对各种非生物和生物胁迫→NADPH氧化酶/超氧化物歧化酶/其他机制促进eH₂0₂的生物合成→调节应激反应和生长发育。

（减数分裂、花粉管的生长、根毛生长、根干细胞生态位维持和脱落等）

eH₂0₂通过水通道蛋白进入胞浆，氧化细胞质。其中几种由H₂0₂共价修饰的蛋白质作为H₂0₂感受器。虽然离子通道和受体已经确定，但在细胞表明上是否存在eH₂0₂感受器是未知的。

eH₂0₂→胞浆Ca²⁺浓度增加→气孔关闭，猜测该通路参与eH₂0₂的感知和信号的传递，但分子机制未知。

二．生物学意义

①识别HPCA1作为eH₂0₂的传感器对于理解植物细胞内Ca²⁺的氧化还原是如何响应各种内外界刺激是至关重要的。

②在细胞表面上发现eH₂0₂感受器的意义重大：将内外部应力或信号转换成eH₂0₂的状态，从而触发统一优化的信号通路，避免全细胞的氧化还原。

③找到eH₂0₂感受器，可以为基因工程作物提供潜在的基因靶点，在生物或非生物逆境下增强抗逆性进和产量。

三．主要结论

基于Ca²⁺成像的前向基因筛查，在拟南芥中分离出了hpca突变体，证明HPCA1是一种富含亮氨酸的受体激酶，在胞外区域有两对多余的半胱氨酸残基，属于之前未注明的一个亚家族。HPCA1定位在质膜上，H₂O₂可以对其胞外的半胱氨酸残基进行共价修饰，使其活化，导致HPCA1胞内区域自磷酸化。在保卫细胞中，可以促进Ca²⁺通道的活跃，诱导气孔的关闭。

四．主要结果

1. hpca突变体的筛选

基于Ca²⁺成像的前向基因筛查，检测到了hpca突变体（常见方法未果）。利用全基因组重测序法，绘制了hpca的图谱（传统的定位方法未果）。其中hpca1现象最明显，它可以影响eH₂O₂信号的整体感知和转导。

（1）在甲磺酸乙酯诱变产生发光蛋白的M2代种子中，筛选4mM H₂O₂下[Ca²⁺]_i

增加减弱的幼苗→分别检测两代，筛选出具有稳定表型的株系。

（2）hpca1/WT：hpca1在H₂O₂下[Ca²⁺]_i增加减弱，但在形态或发育方面无差异。（图1a，b）

     hpca1/WT：hpca1中Ca²⁺增加的高峰降低、对H₂O₂敏感度降低，但对山梨醇和NaCl敏感度一致。（图1c-h）

（3）hpca1/osca1/moca1相邻种植，hpca1不同于其他突变体，在H₂O₂不同处理下具有不同的表型。（附图2a-h）

2. hpca1保卫细胞中受损的eH₂O₂→Ca²⁺信号传导

（1）hpca1保卫细胞中，H₂O₂下，信号减弱，气孔关闭减弱。（图2a-d）

（2）WT保卫细胞原生质体中，H₂O₂下，Ca²⁺电流强。（图2e-g）

（3）hpca1中，在ABA→气孔关闭中存在明显缺陷。（图2h）

（4）hpca1比WT失水更快。（补充数据2i）

hpca1的保卫细胞中eH₂O₂→Ca²⁺以及ABA信号通路中存在缺陷

→hpca1中对eH₂O₂的感知存在缺陷

3. HPCA1编码一种LRR受体激酶

（1）对5个hpca家系进行全基因组重测序→3个hpca家系在同一基因上发生SNP→该基因编码LRR-RK（图3a）。

（编码受体激酶的基因是植物中最大的基因家族之一，LRR-RK是陆地植物中最大的受体激酶家族。）

（2）HPCA1属于Ⅷ-1亚家族，有8个功能未知的成员，都含有两对半胱氨酸残基，命名为过氧化氢区域（HP）。

（3）HPCA1可以弥补hpca1的表型→HPCA1是目标基因。（图3b，c）

（4）分析含有HPCA1启动子驱动的结构的转基因幼苗→HPCA1在子叶和保卫细胞中广泛表达，但在根尖较少。（图3d，e）

（5）【烟草瞬时表达】HPCA1蛋白定位在肿胀的等离子体化细胞的表面周围。（图3f）

{HPCA1在eH₂O₂信号传导中的作用}

（6）hpca1中，eH₂O₂诱导下，MAPK3和MAPK6（eH₂O₂的下游信号）的磷酸化程度降低，且在互补系中恢复。（附图7b）

{HPCA1是否特定于H₂O₂信号传导或还有其他LRR-RKs}

（7）（鞭毛肽flg22、延长因子EF-Tu延生肽elf18、elf26都是MAMPs（微生物表面共有的结构），可以诱导Ca²⁺增加）

fls2和efr（相应受体突变体）    Ca²⁺不增加

hpca1        flg22和elf26诱导的Ca²⁺增加不影响

fls2和bak1   和WT的eH₂O₂信号传导水平一致

ghr1        eH₂O₂诱导的Ca²⁺增加不受影响

在保卫细胞eH₂O₂信号通路中有多个LRR-RK受体，

其中HPCA1或许是GHR1的上游感受器

4. eH₂O₂激活HPCA1激酶

{证明HPCA1激酶活性的必要性}

（1）蛋白激酶抑制剂K252a抑制[Ca²⁺]_i增加，减弱Ca²⁺电流，抑制气孔关闭。（图3h，i）

（2）HPCA1-YEP hpca1-2  随着H₂O₂处理浓度的增加，HPCA1磷酸化程度增加（图3j）

{HPCA1^CD域是否具有激酶活性或作为一个支架}

（3）HPCA1（K695E）^CD、HPCA1（D773L）^CD、HPCA1（Q856*）^CD    ×

HPCA1^CD                MBP可自磷酸化和磷酸化→蛋白迁移率改变

     HPCA1^CD  +γ蛋白磷酸酯酶                                    ×

（图3g，k）

（4） HPCA1 hpca1-2                        √

      HPCA1（K695E）hpca1-2               ×

HPCA1（D773L）hpca1-2               ×

HPCA1（Q685*）hpca1-2               ×              （图3l）

（5）【质谱法】

H₂O₂→Thr786, Thr789, Thr790, Ser606, Ser607 和Ser942 磷酸化程度增加（其中Thr786, Thr789, Thr790在保守催化子域之间）

eH₂O₂激活HPCA1激酶活性，导致HPCA1自磷酸化，传递信号至下游

5. H₂O₂氧化HPCA1的胞外半胱氨酸残基

（半胱氨酸硫醇—^H202→硫酸+SO2=氧化剂信号→动态生物反应的分子开关）

{HPCA1^HP上的半胱氨酸残基是否可被H₂O₂修饰}

（1）

                                             （试剂处理后30min内没有形成电流） 

                                              （图4a-d）

→HPCA1的胞外Cys要形成二硫键，促进CA²⁺电流的形成

→胞外Cys或许是eH₂O₂的感受位点

{Cys残基对于eH₂O₂感应的必要性}

（3）hpca1-2                               ×

     HPCA1 hpca1-2                        √

     HPCA1（C421S/424S） hpca1-2         ×

     HPCA1（C434S/436S） hpca1-2         ×

HPCA1（4C/S） hpca1-2              ×    （图4e，f）

{胞外Cys残基是否处于还原状态，可被氧化}

（4）HPCA1-YFP  hpca1-2 中的Cys_red含量比HPCA1（4C/S）-YFP  hpca1-2 重的更大，Cys_red含量随着H₂O₂的增高而减少（图4g）

→这四种Cys残基在胞外以还原态形式存在，在体内被H₂O₂氧化

{确定胞外Cys被氧化}

（5）H₂O₂→Cys_ox增加  （图4h-j）

eH₂O₂共价修饰HPCA1胞外的Cys残基，作为eH₂O₂的感应机制，

激活HPCA1的激酶活性，打开Ca²⁺通道

五．主要方法

基于发光蛋白质的Ca²⁺成像、对hpca的遗传筛选、光谱学、基于YC3.6的Ca²⁺成像、气孔孔径和密度生物测定、保卫细胞电生理、全基因组重测序定位、系统进化分析、组织化学GUS活性分析、亚细胞定位、重组蛋白纯化及激酶测定、免疫印迹分析、质谱分析

六．讨论

①细胞外空间处于氧化状态，并且暴露在细胞外的蛋白质在向质膜的运输过程中被氧化，如何产生或维持HPCA1胞外Cys_red以防止构成性激活传感器，以及eH₂O₂的Cys_ox是如何再生和还原的分子机制尚待确定。

②除了GHR1，富含半胱氨酸的受体样激酶也在eH2O2的传感和信号传递中起作用。但是，它们在eH₂O₂ Ca²⁺信号中的作用尚未确定。

③包括HPCA1在内的受体激酶下游的 Ca²⁺通道的分子机制还未知。