【EFL观点】软骨的自修复能力有限，目前全世界有上百万患者患有不可治愈的退化性关节疾病。业界焦点在于制造兼顾类似天然软骨力学性能的，又能促进软骨成形的类软骨组织，常规研究是通过制造能够改善软骨细胞分化和软骨成形的支架和生物材料，并借助分化的干细胞和软骨细胞分泌沉积细胞外基质最终形成强力学性能的软骨组织。但是这一过程太耗时间，除此以外，也有方法可以实现组织在制造完成后就拥有类似软骨的刚度，但是这些材料都过硬以至于无法支持细胞的软骨成形。哈佛大学医学院的团队本篇报道展示了通过悬浮支撑打印来模拟天然骨结构。

在组织工程领域，想要开发出一种既能够为运动提供足够力学支撑，又能同时保证软骨细胞成形的软骨组织，仍是一项重大挑战。因为运动时产生的力要求组织要拥有足够的力学性能，而软骨成形则需要一个柔软的微环境。为解决这一困境，作者团队利用两种拥有不同力学性能的生物材料来制造3D类软骨组织：一种是硬的生物材料，来反映天然软骨的宏观力学性能；另一种是软的生物材料，为软骨成形提供一个合适的微环境。其中，悬浮打印的支撑材料是一种PEG胶和海藻酸钠水凝胶的网络互穿聚合物胶（压缩模量MPa级别），它被视为细胞外基质并且拥有自愈合能力。在该支撑材料中，还掺入了凝血酶。随后，将间充质干细胞微球嵌入纤维蛋白原中，并3D打印，制造出一个由纤维蛋白（压缩模量KPa级别）组成的柔软微环境，用于模拟软骨细胞外围基质并保证营养可以快速扩散。生物打印的间充质干细胞微球展现出很高的活性和类软骨行为，且对组织的整体力学性能没有不利影响。因此实现了在力学性能很强的水凝胶中打印柔软的载细胞生物材料。

近期，来自哈佛大学医学院的Su Ryon Shin团队在Advanced Functional Materials杂志上发表题为“3D Printed Cartilage-Like Tissue Constructs withSpatially Controlled Mechanical Properties”的文章，提出了一种利用悬浮3D打印技术，打印载细胞微球，制造类软骨组织的技术。

图1. 生物3D打印类软骨组织示意图

为了可以制造出兼顾力学性能和生物性能的类软骨的组织，首先要设计出一种拥有自愈合能力的凝胶基悬浮打印支撑材料。该材料要能够悬浮打印出载间充质干细胞微球的生物墨水，且自愈合能力可以在数秒内自动修复悬浮打印造成的裂纹（如图1）。作者团队采用了由光交联PEG胶和离子交联的alginate胶组成的互穿网络水凝胶作为支撑材料，交联过后，可以产生MPa级别的力学性能。除此以外，支撑材料含水量很高可以维持其整体刚度，强韧性和粘弹性力学性能。其自愈合能力保证打印结束之后，结构中不会留下永久性裂纹，造成很容易的裂纹扩展，从而保证整体高强度。

为了软骨细胞的功能化，作者团队利用纤维蛋白水凝胶作为软生物材料用于模拟软骨周围基质，该软凝胶还可以解决上述支撑材料渗透率差的缺点，能够快速渗透养分，信号分子和氧气，还能够保护细胞在高强度支撑材料中的高活性。

纤维蛋白水凝胶是一种粘性材料，在用小针头进行高精度或者高速生物打印时，过大的剪切力和拉伸力会使得细胞的活性降低。为了解决这一难题，作者团队将间充质干细胞与纤维蛋白原混合做成载细胞微球，在掺杂着凝血酶的支撑材料中打印，凝血酶渗入纤维蛋白原后，可以进一步形成纤维蛋白水凝胶。生物打印结束之后，PEG-alginate预聚物通过光和离子的双重交联形成互穿网络水凝胶。

图2. 不同PEG浓度的PEG-alginate水凝胶表征

如图2所示，PEG-alginate预聚物在交联过后，由于共价交联的PEG链拥有了高刚度，由于alginate-钙离子链拥有了高韧性。为挑选最优的聚合物混合比例，作者试了3种不同的PEG浓度（15%，20%，25%）混2.5%的alginate，并且表征了不同浓度下复合水凝胶的储能模量，耗散模量以及压缩模量。随着PEG浓度升高，压缩模量增大。由于软骨的压缩模量在0.08-2.5Mpa，所以选择15%PEG-2.5%alginate。作者还表征了结构承受循环载荷的性质，结果显示与天然牛软骨类似。为了评估PEG-alginate水凝胶的流体相，作者还测量了其在PBS中的溶胀特性，水凝胶在8小时候达到溶胀平衡。

图3. 生物墨水和生物打印状态表征

为了评估生物墨水的可打印性，和力学性能（图3），作者表征了支撑材料和纤维蛋白和纤维蛋白原的粘度，流变特性和应力应变曲线。纤维蛋白原的粘度很低且有牛顿流体特性，很难用传统的挤出式3D打印来进行微制造。然而，悬浮打印配合上述支撑材料（有着很好的剪切变稀和非牛顿流体特性），就可以很好的解决这个问题。剪切变稀对于悬浮打印来说是理想流体特性，可以保证在打印过程中，喷头阻力很小。除此以外，假塑性流体在低剪切应力下展现为刚体形貌，使其可以维持打印微结构的形貌和位点。随后，作者研究了不同打印工艺参数对打印纤维直径的影响，以及打印方向和打印密度对于材料整体的压缩模量，应力应变曲线的影响。

图4. 间充质干细胞微球制造和表征

作者随后表征了间充质干细胞微球的制造过程以及微球在高刚度支撑材料中的细胞活性（图4）。作者利用PDMS微孔模具来高通量这早间充质干细胞微球，并表征了微球的直径分布，打印完成后，表征结果显示，当微球嵌在柔软的纤维蛋白水凝胶中时，细胞活性会不对增长，而当嵌在硬的PEG–alginate水凝胶中时，细胞活性则会不断降低。

图5. 打印结构表征

最后作者对打印的类软骨组织，进行了一系列的生物性能表征（图5）。结果显示，细胞不管是在微球的核心还是边缘，都展现出很好的细胞活性。且在纤维蛋白纤维中的微球的代谢活动要明显高于直接混在支撑材料中微球的代谢活动。除此以外，微球在培养了21天之后并不会形成坏死中心，表明纤维蛋白水凝胶可以有效促进营养的渗透，作者还利用FITC标记的右旋糖酐来表针了纤维蛋白水凝胶和PEG–alginate水凝胶的渗透性，证实了这一猜想。

作者还进一步评估了打印组织中的软骨形成活动，并与传统方法对比。根据组织学染色，和免疫组织化学分析结果显示，在用文章方法制造出来的类软骨组织中，干细胞向软骨细胞进行了分化，且组织中有了类软骨行为。半定量的图片分析结果显示，对于所有的基因标记来说，打印出的组织结构中的细胞外基质沉积，相对于传统培养方式的来说，都有明显的提升。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201906330