呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，简称RSV）是一种高度传染性的人类病原体。婴幼儿、老年人、免疫系统受损的个体以及心肺疾病患者都是RSV感染的高危人群。RSV属于肺病毒科（Pneumoviridae）单负链病毒目（Mononegavirales），其基因组为单链负义RNA。RSV的RNA转录和复制由RSV的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，简称RdRP）转录和复制。RdRP由多功能聚合酶蛋白（Large，简称L）和辅因子磷蛋白（Phosphoprotein，简称P）组成。RSV聚合酶中L蛋白由五个结构域组成：RNA依赖性RNA 聚合酶结构域（RdRp）、加帽结构域（Cap）、连接结构域（CD）、甲基转移酶结构域（MT）和C末端结构域（CTD）。而RSV聚合酶中P蛋白可以分为N端结构域（PNTD）、寡聚化结构域（POD）和C端结构域（PCTD）（见图1a）。

RSV中RNA的合成分为起始、延伸和终止三个阶段。在RSV的RNA合成起始过程中，RSV聚合酶识别病毒RNA基因组和反基因组3'端的启动子序列，即Leader（Le）和Trailer Complementary（TrC）。之前的研究表明，RSV聚合酶一个独特的特征是可以在启动子的两个不同的位置启动RNA合成：RNA的复制从启动子的第1位核苷酸开始合成；RNA的转录从Le启动子的第3位核苷酸开始合成。体外酶活实验表明，RSV聚合酶在短Le和TrC模板上可以分别在第1位和第3位核苷酸起始RNA合成。由于缺乏RNA启动子结合的RSV聚合酶的原子分辨率结构，两个不同起始位置的结构基础仍不清楚。

作者通过体外酶活实验选择了10个核苷酸长度的Le和TrC启动子序列（简称Le10和TrC10），解析了RSV聚合酶（L-P复合物）分别与来自病毒RNA基因组和反基因组3'端启动子Le10和TrC10的高分辨率冷冻电镜结构。RNA启动子结合的聚合酶结构中，蛋白结构与apo-form的RSV聚合酶结构十分相似，其中RdRp和Cap结构域形成一个碗状结构，而RNA合成的活性口袋位于碗状结构的中间位置（见图1b）。Cap结构域中的priming loop还是远离RdRp结构域中的活性位点，暗示该结构为pre-initiation的状态。不同的是，RSV聚合酶L蛋白RdRp结构域中的supporting helix在没有RNA结合时是柔性的并不能被3D重构，而在两个启动子结合的聚合酶电镜结构中，supporting helix可以被清楚的重构，表明RNA启动子的结合会导致RSV聚合酶的结构的构象变化，使supporting helix的结构更稳定。

图1：RSV聚合酶的结构示意图和两种pre-initiation状态结构的比较

结构分析显示启动子Le10与RSV聚合酶的复合物中，在聚合酶的活性口袋中有4个核苷酸残基，第5-10位核苷酸残基位于模板进入通道（template entrance channel）中，催化位点氨基酸D811正对着第3位和第4位核苷酸残基，暗示该结构为启动子第3位核苷酸起始RNA合成的pre-initiation状态；而在启动子TrC10与RSV聚合酶的复合物中，在聚合酶的活性口袋中只有2个核苷酸残基，第3-8位核苷酸残基位于模板进入通道中，催化位点氨基酸D811正对着第1位和第2位核苷酸残基，暗示该结构为启动子第1位核苷酸起始RNA合成的pre-initiation状态（图2）。两个结构中，+1催化位点对应的模板RNA上的核苷酸残基均为鸟苷酸（G）。G的碱基与聚合酶L蛋白的氨基酸残基K619，F629以及E778之间有相互作用。其中，G碱基上的氧（O6）与氨基酸残基K619侧链上的氮（NZ）有氢键相互作用，而G碱基上的氮（N2）与氨基酸残基E778侧链上的氧（OE1）有氢键相互作用。这个发现解释了为什么RSV聚合酶在起始RNA合成时，+1催化位点对应的模板RNA核苷酸需要为G。G碱基还与氨基酸残基F629之间有π-π相互作用。这些关键氨基酸残基在单负链病毒目的病毒RNA聚合酶都非常保守（见图1c）。

图2：RSV聚合酶R（L-P复合物）分别与来自病毒RNA基因组和反基因组3'端启动子Le10和TrC10复合物的结构示意图

此外，作者还发现在两个启动子结合结构中，RNA结构在+2和+5催化位点处会翻转约180°，对应与Le10序列中的第5位和第8位以及TrC10序列中的第3位和第6位，之后在+6和+7催化位点处会继续翻转约90°。之前的研究结果显示启动子序列的第3，5，8位核苷酸残基突变后，RNA聚合酶对该模板的活性会明显降低；同时Le10的5-10位以及TrC10的3-8位核苷酸残基均为嘧啶（U或者C）且处于模板进入通道中，当这些核苷酸的碱基突变为嘌呤碱基时，RNA聚合酶对该模板的活性明显小于其突变为嘧啶碱基。结合结构分析，作者推测在RSV聚合酶识别RNA启动子时，倾向于结合模板进入通道中为较小的嘧啶碱基（U或者C）的启动子序列，特别是翻转180°的启动子第3，5，8位核苷酸残基（见图2b和2d）。

图3：不同单负链病毒目的病毒RNA聚合酶的结构比较

在与其他单负链病毒目的病毒RNA聚合酶的结构（包括HMPV、VSV、RABV、PIV5、EBOV 和NDV）进行比较时发现，它们的整体结构十分相似，主要区别在于supporting helix和priming loop的构象。例如，在EBOV聚合酶中，RdRp结构域中的supporting helix距离活性中心更远。在VSV和RABV的L蛋白结构中，Cap结构域中的priming loop插入催化活性口袋，并靠近RdRp结构域的催化活性氨基酸残基D811，而在RSV、HMPV、EBOV、NDV和PIV5的L蛋白结构中，该priming loop远离催化活性氨基酸残基D811，而缩回Cap结构域中，这种差异表明它们处于RNA合成的不同阶段。有趣的时，在PIV5和NDV的L蛋白结构中，包含Cap结构域催化活性氨基酸残基的intrusion loop会靠近RdRp结构域的活性中心，而不是priming loop。为了更好地理解RSV聚合酶RNA合成起始的机制，作者在RNA模板和RdRp结构域活性氨基酸D811中间的-1和+1催化位点处模拟了RNA产物的前两个核苷酸残基并与VSV和RABV聚合酶中的priming loop进行结构比对，发现priming loop上推测的priming氨基酸W的侧链吲哚基团与催化位点-1处RNA产物的第1个核苷酸的碱基平行，可能形成π-π相互作用（见图3）。

综上所述，该研究首次解析了RNA聚合酶与启动子RNA的复合物结构，阐明了RSV中两种RNA合成起始的分子机制，为RSV的抗病毒药物研发提供了新的靶点和结构支持，同时也为其他单负链病毒目的病毒RNA聚合酶的RNA合成机制研究奠定了理论基础。

文章通讯作者为梁波博士，本科毕业于中国科学技术大学，从美国佛罗里达州立大学获得博士学位，之后在哈佛医学院进行博士后研究，现为埃默里大学副教授。

文章第一作者曹冬冬博士，埃默里大学梁波团队助理科学家，本科毕业于中国科学技术大学，并于中国科学技术大学获得博士学位。

梁波实验室研究兴趣包括通过冷冻电镜和晶体学的综合方法研究生物大分子的结构和机制，单负链RNA病毒的RNA合成机制和神经生物学疾病相关蛋白质的折叠机理。团队目前正在招聘博士后，欢迎感兴趣的学生联系。 

https://med.emory.edu/departments/biochemistry/research-labs/liang/index.html

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06867-y