免疫疗法，如免疫细胞移植疗法（ACT）和免疫检查点阻滞疗法（ICB），代表了在对抗肿瘤方面的有效治疗手段。在肿瘤微环境中，CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）作为主要抗肿瘤反应的免疫细胞，其功能持久性和增殖能力的降低限制了免疫疗法的效果。肿瘤中CTLs表现出固有的多样性，其中包括Tpex和Tex细胞，尽管Tex细胞是肿瘤内主要的CTLs并直接杀死肿瘤，但它们逐渐失去增殖能力，并且与Tpex细胞不同，对现有的ICB无法响应。然而，肿瘤中的CTLs分化的基因调控网络以及Tex细胞是否能够被功能性重新激活尚未完全理解。因此，迫切需要系统的研究Tpex到Tex细胞分化的基因调控网络，并探究激活Tex细胞功能和增殖能力的策略。

目前大多数的CRISPR筛选方法依赖于已知细胞分化状态以及相关的表面标记蛋白，因此限制了CRISPR筛选对全新生物学过程及调控因子的研究潜力。相比之下，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）的CRIPSR筛选（scCRISPR）策略对于在复杂细胞群中进行单个基因敲除后转录组分析及功能模块和基因表达精确的研究提供了可行性。目前，在原代免疫细胞中，尚未应用大规模体内scCRISPR筛选进行研究。

在迟洪波教授的指导下，周培培、史豪、黄宏龄等博士在CTLs中利用scCRISPR筛选系统的绘制了CTLs基因调控网络并发现了其分化的检查点及关键的转录调控因子（IKAROS–TCF-1、ETS1–BATF和RBPJ–IRF1）。

首先，他们发现Tpex细胞退出静息状态并连续分化为中间型Tex1细胞（有较强的功能和增殖能力的一群Tex细胞），这一过程由IKAROS和ETS1差异调控。IKAROS促进Tpex1（有较弱增殖能力的一群Tpex细胞）的代谢激活及其分化为Tpex2（有较强增殖能力的一群Tpex细胞）细胞。敲除IKAROS抑制了CTLs的功能，增加了肿瘤内CTLs的干细胞性的同时降低了细胞代谢以及mTORC1信号通路的活性，暗示IKAROS缺陷可能使细胞滞留在过度静止的状态。并且，敲除IKAROS导致的CTL细胞积累无法单独或响应ICB改善抗肿瘤免疫反应。相反，敲除ETS1通过增强mTORC1信号通路活性和代谢重编程来调控Tpex2到Tex1分化过程，并且在多个肿瘤模型中增强了ACT 和ICB的抗肿瘤效果，并且ETS1基因表达量与癌症患者对ICB的响应呈负相关。在机制上，他们揭示了TCF-1和BATF可以分别被IKAROS和ETS1负向调控，是IKAROS和ETS1在CTL细胞中的靶点。

图：肿瘤内CTLs的体内scCRISPR筛选揭示协同功能模块和基因程序的连通性

其次，他们发现敲除RBPJ阻断了中间型Tex1向终末Tex2细胞（有较弱的功能和增殖能力的一群Tex细胞）分化，同时通过增加Tex细胞的增殖能力来扩大Tex1细胞累积。并且，敲除RBPJ在多个肿瘤模型中改善了ACT 和ICB的抗肿瘤效果。另外，RBPJ基因的表达量与来自癌症患者CTLs的终末Tex分化以及癌症患者对免疫检查点阻滞疗法的低反应性正相关。在机制上， RBPJ通过抑制IRF1转录因子的活性来促进了中间型Tex1到终末型Tex2细胞的分化。因此，敲除RBPJ通过增强有较强功能和增殖能力的Tex1细胞的分化来改善ACT和ICB的抗肿瘤效果。

总的来说，他们的研究揭示了肿瘤内CTLs分化和功能的多样性及关键的调控转录因子，并为整合CTLs细胞命运基因调控网络和改善肿瘤免疫反应的潜在靶点提供了一个系统框架。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06733-x