蛋白质是构成细胞和生物体的基本物质，在生物体中发挥着广泛的功能，包括DNA复制、催化代谢反应、作为信使、维持适当的pH值和体液平衡等。蛋白质由氨基酸长链组成，其序列由其基因的核苷酸序列决定；氨基酸链通常折叠成特定的三维结构，从而发挥某一特定的功能。然而，基因序列并不直接编码蛋白质丰度、翻译后修饰或剪接等信息，甚至蛋白质一级序列的细微变化都可能导致有害的效应。因此，一种高效、低成本的蛋白质测序和翻译后修饰鉴定策略对于蛋白质组学研究是非常必要的。

目前Edman降解和质谱法是蛋白质测序的主流方法。但这两种方法无论在测序长度、检测灵敏度、准确性，或者通量和价格上都有一定的局限性。因此，近年来科学家们积极发展新的蛋白质测序方法，包括单分子荧光方法、隧穿电流技术和纳米孔技术。虽然这些方法在肽段的区分，氨基酸的有效识别和多肽的部分测序上有一定的突破，但尚未能够真正实现蛋白质的从头测序。

图：基于纳米孔技术的多肽测序新方法

吴海臣研究组发现，N端为苯丙氨酸的多肽与胍环分子结合后，增加了多肽穿孔的阻滞时间，使α-溶血素纳米孔对其N端第3位点具有超高的分辨率，可对20种氨基酸进行有效区分。通过对比发现，其超高的分辨率并非源于氨基酸的体积排阻，而与氨基酸的极性有直接关系。

接下来研究人员进一步将20种氨基酸通过偶联反应分别连接到N端为苯丙氨酸、C端为8个天冬氨酸的多肽探针上进行区分实验，虽然偶联后α-溶血素纳米孔对20种氨基酸的分辨率略有下降，但利用不同的突变蛋白纳米孔依然对全部20种氨基酸实现了有效的区分。

实现蛋白质测序最关键的步骤是获得氨基酸的序列信息。研究人员利用羧肽酶A和羧肽酶B将肽段中的氨基酸逐一水解，并将游离的氨基酸通过偶联反应连接到多肽探针上，最后通过纳米孔单通道的电流信号确定每个氨基酸的种类，利用其信号丰度确定序列位置，从而成功实现了基于纳米孔技术的多肽序列测定。

相关论文信息：

DOI：10.1038/s41592-023-02095-4