近年来，各类CRISPR基因编辑技术迅速发展。在RNA编辑工具方面，CRISPR–Cas13系统开发最早且目前应用最为广泛。作为一种功能强大的RNA操作工具，Cas13工具包可实现RNA的特异性敲低、编辑、成像和核酸检测等，其在基因治疗领域也具有巨大的应用潜力。与靶向DNA的Cas9不同，Cas13核酸酶可以在crRNA的引导下特异性降解靶RNA。Cas13蛋白还具有独特的反式切割（trans activity）或旁系切割（collateral cleavage）活性，即在crRNA和靶RNA同时存在的情况下，激活的Cas13会非特异性地切割其周围的其它RNA。这种非特异切割活性往往会干扰Cas13对RNA靶向的准确性并引起细胞毒性，但另一方面，人们正是利用该特性开发了多种基于Cas13的核酸检测工具。此外，Cas13蛋白还具有额外的RNase活性，可实现其自身pre-crRNA的加工。

欲使用CRISPR-Cas13工具，需要高效的递送系统将其导入到靶细胞之中。其中，基于慢病毒载体的递送系统，在各种基因编辑工具的递送中应用广泛，不仅可应对多种难转染细胞的体外递送，也被FDA批准用于多种疾病基因治疗的临床应用。然而，与靶向DNA的Cas9相比，尽管人们对使用Cas13很感兴趣，但目前公开发表的应用Cas13系统的报道仍相对较少。其中，成功使用慢病毒载体递送Cas13系统的报道则更为有限。因此，有理由猜测Cas13系统的慢病毒载体递送可能存在一定问题，这种潜在问题极大地限制了Cas13系统的广泛应用。

在本研究中，作者首先将多种常见的Cas13系统（包括Cas13a、Cas13b和Cas13d）构建至慢病毒载体，包括单载体形式（Cas13蛋白与crRNA在同一个载体中）和双载体形式（Cas13蛋白与crRNA在两个载体上独立表达）。经HEK293FT细胞包装产毒后，感染多种常用细胞系，检测Cas13蛋白及其crRNA在靶细胞中的转导效率、表达水平及靶基因敲低效果。结果显示，个别形式的Cas13系统自身（如单载体或双载体Cas13a，以及单载体Cas13b）存在显著的慢病毒载体的递送缺陷，通过慢病毒颗粒递送的Cas13 RNA无法在靶细胞中整合至基因组，Cas13蛋白也因此无法在靶细胞中表达，该缺陷与是否插入特定crRNA无关。相比而言，双载体Cas13b、单载体或双载体的Cas13d系统本身（不插入特定crRNA）则并无明显的慢病毒载体递送问题。进一步地，研究人员利用高通量的CRISPR-Cas13筛选及机器学习等技术，发现特定的crRNA序列也能够导致单载体Cas13d系统出现慢病毒载体递送缺陷。鉴于以上结果，并结合蛋白稳定性及敲低效率等多因素综合分析，研究人员提出了利用慢病毒载体递送Cas13的一般性指导原则：首先，Cas13a不能用慢病毒载体递送；其次，Cas13b只能以双载体的形式通过慢病毒载体递送；第三，使用Cas13d时，如用单载体形式慢病毒载体递送，需精心设计crRNA，规避特定序列基序；第四，优先推荐使用双载体的Cas13d慢病毒载体系统。

图：Cas13系统慢病毒载体递送效率的评价及内源RNA靶基因的鉴定

在分子机制层面，研究人员通过一系列多组学、生化及分子实验，发现Cas13蛋白作为一种RNase，可以在不依赖于crRNA的情况下直接结合或切割慢病毒包装细胞HEK293FT中的一系列内源RNA分子，且病毒相关的生物学过程在这些RNA靶基因群中显著富集，个别靶基因在HEK293FT细胞中的功能失活可显著抑制其包装的慢病毒载体在靶细胞中递送及表达能力。体外生化实验直接证明了Cas13蛋白可以直接特异性切割内源RNA分子，而RNase活性突变的Cas13蛋白则显著失去了这种切割能力。研究人员进一步发现，利用单点突变破坏Cas13a的pre-crRNA加工活性后，Cas13a的慢病毒载体递送缺陷可得到完全恢复。这些结果表明，Cas13可能通过直接靶向HEK293FT细胞中的病毒包装相关的功能基因，从而影响其慢病毒颗粒的质量进而造成靶细胞递送的障碍。这种新型的内源RNA靶向活性可不依赖于crRNA，且其RNA切割具有序列特异性，因此显著区别于已知的Cas13旁系切割活性。Cas13核酸酶的构象和激活状态的改变也会影响内源RNA的靶点选择性。研究人员推测，Cas13核酸酶在哺乳动物细胞中的这种内源RNA靶向活性可能具有相当的普遍性，除影响慢病毒载体递送外，这种活性在其它靶细胞中的RNA靶点及其潜在影响还需进一步评估。

总结而言，该研究揭示了RNA编辑工具CRISPR-Cas13在哺乳动物细胞中展现出的一种新型内源RNA靶向活性，并提出了一套利用慢病毒载体递送Cas13工具的实用性使用原则，提示了在Cas13使用过程中应警惕内源RNA靶向活性造成的潜在影响。

同期，Nature Biomedical Engineering杂志专门配发了题为“Intrinsic RNA targeting constrains the utility of CRISPR-Cas13 systems”的研究简报（Research Briefing），对本项研究成果进行推介。此外，本研究也是该合作研究团队继2023上半年在Nature Communications上揭示CRISPR-Cas13d系统crRNA设计原则后（PMID: 36765063），在Cas13领域取得的又一项重要成果。

东北大学生命科学与健康学院费腾教授和美国华盛顿特区儿童国家医学中心李炜教授为该论文的共同通讯作者，费腾课题组博士生李泽旭、黎子涵和李炜课题组博士后程孝龙为共同第一作者。

费腾课题组常年招收具有基因编辑、肿瘤及生物信息学等研究背景的博士后，联系方式：feiteng@mail.neu.edu.cn。

李炜课题组近期诚招计算生物、AI及基因编辑方向博士后，联系方式：wli2@childrensnational.org。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41551-023-01109-y