基因表达被定义为一种由基因主导的，产生可观测表型的生物学过程，包括基因转录形成RNA，及RNA翻译为蛋白等。细胞功能很大程度上由胞内的RNA分子的表达水平决定，因此这些RNA受到合成、剪接和降解等多种机制的动态严格调控。然而，了解全基因组 RNA 动力学调控机制受到现有技术的限制。现有的基因表达检测技术通常只能提供转录组快照，即采样瞬时的总体转录组表达水平，难以反映RNA合成，间接，降解这些快速的动态过程。此外，尽管平行遗传扰动结合单细胞转录技术已经揭示了丰富的基因调控信息，现有技术的规模受制于高昂的成本，难以满足大规模筛选的需求。为了解决这些局限，作者开发了 PerturbSci-Kinetics以揭示广泛遗传扰动对单细胞转录组动态的影响。

基于曹俊越课题组此前开发的最新超高通量单细胞测序技术EasySci，作者首先开发了超高通量单细胞遗传扰动技术PerturbSci。通过Split & pool策略， PerturbSci 在逆转录，DNA连接，和PCR步骤中为细胞内的cDNA分子加上三组DNA条码。PerturbSci在逆转录步骤加入dT引物捕获polyA RNA，同时使用sgRNA引物靶向捕获胞内CROP-seq慢病毒整合表达的长sgRNA 转录本，且它们共享相同的DNA条码。在全转录组PCR后，通过进一步PCR 靶向富集 sgRNA 序列，可进一步得到可单独测序的与单细胞全转录组拥有对应DNA条码的sgRNA文库。用三轮组合索引策略，PerturbSci单次文库构建通量可达百万单细胞。作者使用表达dCas9-KRAB-MeCP2的细胞系进行PerturbSci文库构建，数据显示该方法具有极高的单细胞sgRNA捕获率（高达 99.7% 的细胞拥有对应的sgRNA）、并可有效反映单细胞层面的 sgRNA 身份及靶基因敲减。

图1：PerturbSci-Kinetics可通过汇合CRISPR筛选来同时实现转录组动态分析和高通量基因扰动

此外，通过对细胞培养基加入4sU（一种尿苷类似物），以及对固定后的被标记细胞进行原位化学转化反应， 4sU标记的新生单细胞转录组cDNA会携带T>C突变，从而得以与已经存在的转录组区分。通过进一步结合PerturbSci与RNA代谢标记，作者开发了PerturbSci-Kinetics，用于捕获单细胞层面的新生转录组，全转录组，以及sgRNA序列。通过一系列分析，作者证明了4sU标记新生转录组的特异性，以及其与PerturbSci的兼容性。

接下来作者构建了靶向228个与表达调控潜在相关的基因的CROPseq sgRNA慢病毒文库，进行了PerturbSci-Kinetics筛选。通过对扰动后的转录组进行降维分析，被靶向具有相似功能基因的转录组表现出更高的相似性。通过进一步使用微分方程解析sgRNA靶基因的合成和降解速率，作者发现sgRNA靶基因的表达降低主要是由于RNA合成受到抑制，这与CRISPRi的工作原理相吻合，进一步验证了方法的有效性。

作者比较了接受不同扰动后的总体RNA合成和讲解速率的变化，发现敲减转录相关基因通常导致RNA合成降低，而鉴定出的导致RNA降解受损的扰动靶向编码RNA加工，RNA降解因子的基因。此外，沉默常见编码剪接子的基因及编码线粒体电子传递链蛋白的基因表达，在数据集中显示分别显著影响RNA加工及线粒体转录组更新。有趣的是，通过PerturbSci-Kinetics，作者发现敲低RNA诱导沉默复合体成员AGO2导致了总体RNA合成的增加。通过重分析已发表数据及实验验证，作者证明了AGO2通过转录起始后暂停机制抑制转录。

图2：利用PerturbSci-Kinetics来分析遗传扰动对基因特异性转录和降解动态的影响

作者进一步分析扰动后差异表达基因的RNA合成和降解速率变化。例如，敲低DROSHA和DICER1，两个编码处理微小RNA的RNase基因后，两组扰动表现出显著重叠的降解速率显著降低的基因。且尽管这些基因显示出总体转录组的表达上调，但通过PerturbSci-Kinetics作者发现它们的上调是由于降解速率的下降。重分析AGO2-RNA结合图谱进一步提示这些基因的表达上调及降解速率的下降来自扰动后微小RNA的缺失。

此外，通过分析扰动对细胞周期进程中RNA动力学的影响，作者发现了广泛存在的RNA表达补偿机制，即细胞可通过降低RNA合成速率来补偿受损的RNA降解速率，进而保持总体RNA表达水平的稳定。以上的结果证明了PerturbSci-Kinetics广泛的应用前景。

相关论文信息：

10.1038/s41587-023-01948-9