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《细胞》：冯越/Joseph Bondy-Denomy团队合作揭示噬菌体抑制和逃逸细菌CBASS免疫系统的分子机制
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2023年2月6日，美国加州大学旧金山分校Joseph Bondy-Denomy教授团队与北京化工大学冯越教授团队合作在Cell在线发表了题为“Bacteriophages inhibit and evade cGAS-like immune function in bacteria”的研究论文，报道了噬菌体抑制和逃逸细菌CBASS免疫系统的机制。
环状GMP-AMP合成酶cGAS是一种属于DNA传感器家族的酶，可以识别来自病原体等外来入侵者以及自身的DNA。在哺乳动物细胞中，环状寡核苷酸2’, 3’-cGAMP在干扰素基因刺激通路中起着至关重要的作用，cGAS产生的2’, 3’-cGAMP作为信号分子与STING（IFN基因的刺激因子）结合，随后诱导TBK1-IRF3依赖性地产生IFN-β，导致DNA驱动的免疫反应，根据信号强度的不同，STING也会进一步激活其他细胞过程，如细胞凋亡或坏死等[1]。近期，在细菌中也鉴定出了数千种名为CD NTase的cGAS样酶，这些酶在噬菌体感染期间通过未知机制被激活，并产生环状寡核苷酸以激活下游的效应蛋白，这种细菌免疫策略被定义为基于环状寡核苷酸的抗噬菌体信号系统（cyclic-oligonucleotide-based antiphage signaling system），简称为CBASS系统[2]。
CBASS系统是一种广泛存在于细菌和古细菌中的抗噬菌体免疫防御系统，由环状GMP-AMP合成酶 CD NTase和下游效应蛋白组成，这些效应蛋白可以通过细胞膜降解、噬菌体和宿主DNA的裂解、跨膜孔洞的形成及多种未知的作用方式杀死被噬菌体感染的细菌或抑制细菌生长，从而成功阻止噬菌体增殖。细菌通过CBASS系统介导的抗噬菌体感染的免疫防御又称“流产感染（或顿挫感染）”，这一过程涉及细菌从感应噬菌体到启动个体自杀，最终使细菌群体产生对噬菌体的免疫防御的分子机制。通俗而言，其本质是通过牺牲被噬菌体感染的部分细菌，从而保护其他细菌不被更多子代噬菌体感染。CBASS系统根据结构域的组成可分为四类，I型CBASS由一个紧凑的双基因系统组成，仅包含CD-NTase和效应蛋白等核心基因，而II型、III型和IV型 CBASS中还包含多种可调节CD-NTase活性的特性基因[3]。
噬菌体感染细菌后将遭遇细菌免疫系统的抵抗，但噬菌体同时也采用多种策略对抗细菌的免疫系统，目前研究最清楚的是噬菌体可编码多种蛋白质以抑制宿主免疫系统如CRISPR-Cas以及限制性修饰系统，但目前尚不清楚噬菌体是否有抑制或逃避CBASS免疫系统的机制。近期美国哈佛大学Philip J. Kranzusch课题组发现了一个由噬菌体编码的抗CBASS系统的磷酸二酯酶（命名为Acb1），Acb1与真核病毒编码的poxin酶相似，具有切割环状寡核苷酸的功能[4]。
CBASS系统的发现和研究标志着原核和真核生物免疫系统之间的联系，但在这一新兴领域中，关于噬菌体-宿主进化以及CBASS调控和激活机制的许多问题尚未解决，而内源性CBASS模型系统可有效地帮助这些问题的阐明。在本文中，Joseph Bondy-Denomy课题组通过生物信息学分析，共计筛选出252株不同的含有CBASS系统的P. aeruginosa菌株，使用CRISPR-Cas技术将其CBASS基因座敲除，最终筛选出一种具有天然功能性的CBASS免疫系统的菌株P. aeruginosa BWHPSA011 (Pa011)。该菌株含有cGAS样环状GMP-AMP合成酶CdnA，其可产生3’, 3’-cGAMP用以响应PaMx41噬菌体感染，从而激活磷脂酶(CapV)效应蛋白，发挥CBASS系统的免疫功能。
而PaMx41噬菌体的逃逸突变体可产生一种抗CBASS系统的蛋白Acb2，那么Acb2如何发挥其抗性功能呢？冯越教授课题组结合生物化学、结构生物学等多种手段，阐明了Acb2抑制CBASS系统的功能机制。首先，他们通过体外生化实验发现Acb2可高效结合3’, 3’-cGAMP分子，但不具有酶活。冯越课题组解析了Acb2蛋白及其结合3’, 3’-cGAMP的复合物的结构，结构显示Acb2蛋白自身为一个紧凑的六聚体结构，其可结合3个3’, 3’-cGAMP分子，每个3’, 3’-cGAMP分子位于两个Acb2单体N端形成的“结合口袋”中，且与Acb2的Y11残基形成稳定的π–π相互作用（图1）。由于Acb2可以吸附并隔离3’, 3’-cGAMP，导致无法激活CBASS系统下游的效应蛋白，因此Acb2有效地破坏了CBASS系统的免疫作用。
图1 Acb2及其结合3’, 3’-cGAMP的结构
后续通过体外生化实验，他们又进一步证实了Acb2还可以结合c-di-AMP/2’, 3’-cGAMP/3’, 3’-cUA/UG/UU等多种寡核苷酸信号分子，覆盖I型和II型两种CBASS系统，显示出Acb2是一种基于cGAS酶的免疫系统的广谱抑制蛋白。此外他们还发现，Acb2的缺失会造成CBASS系统阻断噬菌体的复制及溶原诱导，但少数噬菌体会通过主要的衣壳基因的突变来逃避CBASS系统的免疫作用（图2）。
图2 噬菌体抑制和逃避CBASS免疫系统的策略
综上，本文发现了内源性CBASS系统的抗噬菌体免疫作用，并提出了噬菌体抑制和逃避CBASS免疫系统的有效策略。Acb2蛋白作为广谱抑制蛋白，其可以通过结合多种环状寡核苷酸来抑制多种类型的CBASS系统。美国加州大学旧金山分校博士研究生Erin Huiting与北京化工大学博士研究生曹雪利为本论文的共同第一作者，北京化工大学冯越教授与加州大学旧金山分校Joseph Bondy-Denomy教授为共同通讯作者。
冯越教授研究组一直致力于利用结构生物学、生物化学、细胞生物学等多种手段研究病原与宿主相互作用的分子机理。目前以通讯作者身份在Nature、Cell、Mol. Cell、Nat. Chem. Biol.、PNAS、Nat. Plants、Nat. Commun.、Nucleic Acids Res.等杂志发表论文多篇。课题组长期招聘博硕士研究生及博士后，欢迎感兴趣的同学加盟或来函咨询 (forest66318@163.com)。
相关论文信息：
https://doi.org/10.101 6/i.cell.2022.12.041
参考文献
1.Ishikawa, H., and Barber, G.N. (2008). STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling. Nature 455, 674–678. 10.1038/nature07317. 2.Cohen, D., Melamed, S., Millman, A., Shulman, G., Oppenheimer-Shaanan, Y., Kacen, A., Doron, S., Amitai, G., and Sorek, R. (2019). Cyclic GMP-AMP signalling protects bacteria 1014 against viral infection. Nature 574, 691–695. 10.1038/s41586-019-1605-5. 3.Millman, A., Melamed, S., Amitai, G., and Sorek, R. (2020). Diversity and classification of cyclic-oligonucleotide-based anti-phage signalling systems. Nat Microbiol 5, 1608–1615.10.1038/s41564-020-0777-y. 4.Hobbs, S.J., Wein, T., Lu, A., Morehouse, B.R., Schnabel, J., Leavitt, A., Yirmiya, E., Sorek, R., and Kranzusch, P.J. (2022). Phage anti-CBASS and anti-Pycsar nucleases subvert bacterial immunity. Nature 605, 522–526. 10.1038/s41586-022-04716-y.
https://blog.sciencenet.cn/blog-3423233-1375208.html
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