光合作用是最重要的化学反应之一，为地球上几乎所有生物提供了物质和能量的来源。光合作用维持着大气中氧气和二氧化碳的相对稳定，是地球生物赖以生存的关键。叶绿体是绿色植物和藻类等真核自养生物的细胞中进行光合作用的细胞器。针对叶绿体的研究对植物、农业、生态等多领域有着重要的影响。

根据内共生学说，叶绿体起源于十亿年前的一次吞噬事件——一个蓝细菌被原始真核细胞内吞，逐渐演化成为胞内的一个具有双层膜结构的细胞器。在叶绿体演化的过程中，其自身的遗传物质逐渐转移到细胞核中，自身保留仅编码100多个蛋白的基因组。多达2000-3000种叶绿体蛋白由细胞核基因编码，并在细胞质中翻译成为带有转运信号肽的前体蛋白，最终转运至叶绿体内发挥功能。那么前体蛋白如何被识别并跨过叶绿体双层膜进入叶绿体？研究人员经过近四十年的探索，认识到这个关键的过程是由叶绿体外膜转运子TOC 与叶绿体内膜转运子TIC 共同完成的。TOC和TIC对于叶绿体功能和稳态发挥着至关重要的作用，但是人们对其的了解还非常有限，仍有很多关键的科学问题没有解决。比如，TIC到底是由哪些组分组成，这个核心问题在领域内争论了几十年。而TOC和TIC又是如何形成超级复合物来行使功能的也不清楚。

为了回答上述问题，闫浈课题组尝试利用生物化学和结构生物学的方法来揭示TOC-TIC复合物的组成、组装和转运机制。通过对前人研究成果的分析归纳，闫浈课题组选择了克莱因衣藻的TOC-TIC超级复合物为研究对象，在两个已被确认并在不同物种中高度保守的TOC（Toc34）和TIC（Tic20）组分上分别加亲和标签进行纯化。生化和质谱结果表明经过两种不同策略所纯化出的TOC-TIC超级复合物组分基本一致，并且经体外实验验证都具有结合底物前体蛋白的能力。课题组进一步解析了两种蛋白样品的单颗粒冷冻电镜高分辨率结构，结果也高度一致。以上实验证据共同确定了叶绿体蛋白转运超级复合物的组分，为平息领域内的争论提供了直接有力的证据。

结构清晰地展示了两处去垢剂盘密度，揭示了叶绿体蛋白转运复合物TOC-TIC横跨叶绿体双层膜的基本特征。解析的TOC-TIC超级复合物一共包含14个组分，其中8个为之前已报道的组分，6个为功能未知的新组分。进一步结构分析表明，超级复合物包含了一条从TOC到TIC的亲水通道，可能是潜在的用于前体蛋白转运的路径。课题组结合交联质谱实验初步验证了该结构模型。课题组还通过进化分析，推测了多个在高等植物中潜在的TOC-TIC蛋白组分，其中一个组分Tic12在近期被报道是拟南芥中TIC的新组分，这与结构研究高度吻合。因此，该工作不仅揭示了藻类植物TOC-TIC超级复合物结构，也为理解其他含叶绿体物种中的TOC-TIC复合物的组成和组装提供了重要线索，为后续深入理解其在物种间的进化奠定了重要基础。

图1. 跨越双层膜的叶绿体蛋白转运体结构

该研究利用结构生物学方法做到“眼见为实”，首次看清TOC-TIC超级复合物横跨双层叶绿体膜的全貌，并鉴定出其各个组分。其中一些组分，例如Tic214和Tic100，它们的单独结构都是相对无序零散的，但是彼此缠绕共折叠形成非常稳定的复合物。值得一提的是，AlphaFold2的预测结构与它们的实际结构相差甚远。此外，结构中还发现了一个植酸（IP6）和多个植物脂类分子（MGDG）参与介导TOC-TIC的组装，可能对其功能具有重要的调控作用。这些全新的发现彰显了生物化学和结构生物学的魅力，是目前AI预测手段无法做到的。

论文的一位匿名审稿人评价道：“该研究用纯化并解析结构这个‘终极手段’解决了光合物种叶绿体生物学的一个核心问题。该研究为增进理解和认识藻类、植物叶绿体如何发展进化迈出了一大步。因为叶绿体生物学对食品安全与气候变迁的潜在影响，以及对蛋白如何转运这种问题的基础性，该研究也为其他非特定领域的科学家们带来了非常有价值的信息。”

西湖大学特聘研究员闫浈为本文通讯作者。西湖大学博士后金泽宇、西湖实验室开拓学者万里为本文共同第一作者。西湖大学吴建平、李小波，北京生命科学研究所董梦秋、曹勇，清华大学潘俊敏、李学成等参与了课题合作。

该项研究得到西湖大学冷冻电镜平台，西湖大学高性能计算平台，西湖大学质谱平台的大力支持。本工作获得了西湖大学、西湖实验室的经费支持。

闫浈课题组利用生物化学、结构生物学等多种技术手段，研究重要蛋白复合物的结构与机理，如叶绿体发生发育与稳态相关蛋白的结构与功能。

课题组招收具有生物化学、结构生物学、分子生物学等背景的博士后、科研助理；招收本科、硕士起点的博士研究生；同时，欢迎优秀的本科生前来做毕业设计。课题组将根据成员的背景和职业规划量身定制培养计划，旨在培养优秀的科研人才。

闫浈实验室链接：

https://www.westlake.edu.cn/faculty/zhen-yan.html

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.030