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《自然—生物技术》：芝加哥大学何川团队开发出基于单碱基分辨率的mRNA假尿嘧啶定量测序方法
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北京时间2022年10月27日晚23时，美国芝加哥大学何川教授团队在Nature Biotechnology在线发表了标题为“Quantitative sequencing using BID-seq uncovers abundant pseudouridines in mammalian mRNA at base resolution”的研究论文。
该研究提出并开发了对mRNA上Ψ修饰进行单碱基分辨率、定量测序的测序方法（Bisulfite Induced Deletion sequencing），简称BID-seq。BID-seq以高精度测序谱图揭示了在人类细胞系和动物组织的mRNA上数以千计的显著性Ψ位点（>10%修饰化程度，modification fraction），以及大量的高修饰Ψ位点（>50%修饰化程度）。
何川教授团队以此进一步鉴定了mRNA上Ψ修饰的“书写蛋白”，发现了高修饰Ψ位点对mRNA代谢的影响，以及论证了哺乳动物mRNA的终止密码子上天然存在的Ψ修饰。
近年来， DNA与RNA甲基化修饰及其发挥的重要生物学功能受到了表观遗传学、生物医学等领域的广泛关注。在RNA修饰（RNA modification）领域，除了经典的核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）上的诸多种类的RNA修饰，信使RNA（mRNA）上的RNA修饰在近几年得到了科学界的广泛研究。6-甲基腺嘌呤（m6A）被鉴定为哺乳动物信使RNA（mRNA）上最高丰度的甲基化修饰，也是迄今为止功能最广范的mRNA修饰，其通过影响mRNA的降解、翻译、出核运输、剪接等过程，从而显著调控细胞的基因表达 【1,2】。在哺乳动物mRNA上，除了丰度最高的m6A，还存在着多种已被证实的mRNA修饰，例如假尿嘧啶（pseudouridine，Ψ）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、1-甲基腺嘌呤（m1A）、2’-氧甲基化（2’-O-methylation, Nm）、mRNA内部的7-甲基鸟嘌呤（internal m7G）等（图1）。根据质谱学定量，其中假尿嘧啶（Ψ）在mRNA上的丰度与m6A最为接近，是目前发现的哺乳动物mRNA第二大修饰。
图1. 人类mRNA上RNA修饰的大致丰度。
由于m6A修饰在mRNA上的高丰度以及已有的针对m6A的高效特异性抗体，基于IP的m6A-MeRIP-seq被广泛用于对mRNA m6A的位点分布进行测序，从而推动了对mRNA上m6A生物学功能的大量研究。然而，Ψ作为哺乳动物mRNA上丰度第二高修饰，其在mRNA上的是否发挥着重要的调控功能目前尚不完全清楚。长期以来，在针对mRNA上Ψ生物学功能的研究中，最大的瓶颈就是缺乏一种像m6A-MeRIP-seq这样的高效测序方法。所以，如何以单碱基分辨率对mRNA上的Ψ位点进行定量测序，一直是RNA表观转录组领域的一个难题。
在方法的开发过程中，研究人员通过对bisulfite化学反应机制的研究 【3,4】，筛选出来了能够将Ψ修饰完全转化为Ψ-BS复合物的化学反应条件 (图2A)，并进一步优化使反转录酶在反转录过程中在Ψ-BS复合物位点处跳跃读取下一位碱基，构成在Ψ-BS位点处的碱基缺失信号（deletion signature），从而实现了Ψ修饰的单碱基分辨率测序方法；在此过程中产生的deletion信号强弱，可被用于衡量此处Ψ修饰化程度的高低，为mRNA上Ψ修饰的定量测序、动态监测铺平了道路 （图2B）。由于BID-seq的核心步骤完全基于化学反应，使得该方法不需要任何酶促反应，整体流程易于操作与重现，在很大程度上可以与经典的的DNA 5mC的bisulfite测序方法媲美。值得一提的是，与传统的bisulfite反应不同，BID-seq的化学反应条件只针对于Ψ修饰，并不产生任何C到U的转化，完全保留了mRNA片段在测序中的序列复杂度。
图2：BID-seq策略图。（A）BID-seq化学处理可将Ψ完全转化为Ψ-BS复合物。（B）BID-seq测序建库流程图。
首先，为了验证方法的效率和普适性，研究人员合成了包含NNΨNN 256种motif context的RNA探针，BID-seq在231个motif上呈现>50%的deletion率，并在252个motif上呈现>25%的deletion率，此高效性是将BID-seq大规模用于生物样本的基石 （图3A）。随后，研究人员将BID-seq运用在了HeLa、HEK293T和A549细胞系并鉴定出500~1000个显著性Ψ位点（>10%修饰化程度），同时在老鼠组织中也鉴定了1000~7000个显著性Ψ位点 (图3B)。这些位点很大一部分体现出高修饰化程度 （>50% modification fraction）(图3C)，并集中分布在转录本上的CDS、3’ UTR以及终止密码子附近。虽然显著性Ψ修饰位点在细胞系的mRNA上仅有几百个，在不同动物组织里的mRNA上基本都在几千左右，总体丰度和m6A基本接近， 预示了哺乳动物体内mRNA上广泛存在的调控机制。在技术层面，BID-seq不依赖于任何抗体，可实现对微量RNA样本（10~20 ng RNA）中的Ψ位点进行测序，在单碱基分辨率追踪Ψ修饰化程度的动态变化。
其次，通过构建一系列针对Ψ修饰酶（PUS，pseudouridine synthase）的基因敲除细胞系，研究人员发现mRNA上Ψ修饰可由8种不同的PUS酶分别调控，其中以TRUB1和PUS7最为显著。并且，由TRUB1调控的一系列高修饰Ψ位点（>50%修饰化程度），体现出与mRNA稳定性的密切关系。值得一提的是，我们知道体外合成的mRNA终止密码子上的Ψ修饰会导致终止密码子的读通性改变【5,6】 ，而由于测序技术的瓶颈，人们一直无法论证哺乳动物mRNA终止密码子上是否有天然存在的Ψ。在此项研究工作中，BID-seq在HeLa细胞和十二种老鼠组织中鉴定出了一百多条mRNA在终止密码子上携带显著性Ψ位点（>10%修饰化程度），并发现这些Ψ对于一部分mRNA终止密码子的读通性产生明显改变，这一结果回答了RNA表观转录组领域的长期疑问。
图3：BID-seq揭示哺乳动物mRNA上广泛存在的Ψ修饰位点及其修饰化水平定量。（A）BID-seq对于合成的RNA探针上NNΨNN（100%修饰程度的Ψ）256种不同的motif体现出高deletion率。（B）BID-seq所揭示的mRNA上Ψ位点数目。（C）BID-seq所揭示的mRNA上Ψ位点的修饰化程度（modification fraction）。
BID-seq攻克了Ψ定量测序技术瓶颈，为研究mRNA上Ψ修饰在诸多生理或病理过程中的位点分布、修饰化程度动态变化、生物学功能等，奠定了技术基础，有望与最新开发的m6A-SAC-seq【7】携手引领RNA表观转录组领域步入新的阶段。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41587-022-01505-w
参考文献
1. Zhao, B.S., Roundtree, I.A., and He, C. (2017). Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31–42. 2. Roundtree, I.A., Evans, M.E., Pan, T., and He, C. (2017). Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell 169, 1187–1200. 3. Fleming, A.M. et al. (2019). Structural Elucidation of Bisulfite Adducts to Pseudouridine That Result in Deletion Signatures during Reverse Transcription of RNA. J. Am. Chem. Soc. 141, 16450–16460. 4. Khoddami, V. et al. (2019). Transcriptome-wide profiling of multiple RNA modifications simultaneously at single-base resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116, 6784–6789. 5. Karijolich, J. & Yu, Y.-T. (2011). Converting nonsense codons into sense codons by targeted pseudouridylation. Nature 474, 395–398. 6. Fernández, I. S. et al. (2013). Unusual base pairing during the decoding of a stop codon by the ribosome. Nature 500, 107–110. 7. Hu, L. et al. (2022). m6A RNA modifications are measured at single-base resolution across the mammalian transcriptome. Nat. Biotechnol. 40, 1210–1219.
https://blog.sciencenet.cn/blog-3423233-1361297.html
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