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北京时间2022年7月13日晚23时,美国康奈尔大学可爱龙实验室在《分子细胞》(Molecular Cell)杂志发表基于type I-A系统的新机制解析和新应用开发的研究成果。
三国有云“天下大勢,分久必合,合久必分”。自然科学亦如是。
CRISPR-Cas系统是原核生物一种抵御外来入侵核酸的免疫系统,已被广泛用于真核细胞的基因组编辑。目前基于CRISPR-Cas的基因编辑技术已广泛应用于遗传育种、新药开发、疾病治疗、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域。被誉为在后基因组时代开创了遗传疾病精准治疗的新时代。
CRISPR-Cas系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为Class I和Class II(一型和二型)。单亚基效应物的Class II家族包括大家常用的Cas9, Cas12, Cas13等,因其简单、高效、普适性的特性,其应用早已风靡全世界实验室。如果从分布比例上看,多亚基类型的Class I家族才是CRISPR-Cas系统的“名门望族”,其占比超过75%,对比Cas9,Cas12,Cas13总和也不过10%左右,可谓呈“辗轧之势”。然而Class I家族CRISPR-Cas系统,因为多亚基特性,其样品的获取,操作的编辑性,功能、机制的研究等都显得相对难度更大,因此该家族的研究和应用一直滞后很多。
不过近些年,Class I家族引起低脱靶,低毒性,功能更丰富多彩的特性,正逐渐展现出特有的魅力(1-7)。不过Class I家族庞大,成员众多,同时每一亚类可能又展现不同的性质,因此对这一庞大家族的了解也不透彻。
对于Type I系统,大家普遍认知的工作机制是Cascade首先靶向目标DNA,形成full R-loop之后,再招募Cas3完成对靶标DNA的切割和水解。简而言之就是:“分—合—分”机制。然而可爱龙实验室胡纯一博士等人发现Type I-A 系统一个显著不同于type I其他系统的性质:Cas3与Cascade是形成一种内在的复合物,而不依赖于目标DNA靶向与否,简言之就是“合-合-合”。(如下图所示)
分分合合与否,固然鲜明。然而CRISPR系统最重要的一项性质就是:该系统如何去避免脱靶效应,从而降低非特异性的切割?其他的Type I系统利用Cas3的招募与否来规避脱靶效应(非特异性的靶向不能招募Cas3)。因此,Cas3一直结合在Cascade上的type I-A系统又是如何去规避这一难点?
胡纯一博士联合瑞士洛桑大学/瑞士联邦理工学院Henning Stahlberg实验室倪冬春博士等人,使用冷冻电镜全面解析了type I-A 系统九种状态下的全景工作机制。这些捕获的工作状态桥段,确切的表面,Cas3通过与Cas8的互作,从而成为Cascade的内在一部分,并且Cas3通过稳定Cas8的N端构象,极大的促进了PAM识别和DNA靶向,该结果表面Cas3的内在性是具有积极和重要作用的。重要的是,他们发现,type I-A Cascade结合DNA形成完全互补配对的full R-loop结构之后,通过层层构象变化,最终传递给Cas3产生一个巨大的构象改变,暴露核酸酶活性中心,从而开始切割靶向DNA。而部分结合(非特异性结合)靶标形成的partial R-loop结构不能产生这种刺激,Cas3核酸酶依然保持抑制状态,从而避免脱靶切割 (如下图)。
众云“合(和)为贵”,那么这套type I-A系统独特的吸引力在哪里?胡纯一博士等人发现,type I-A 内在式的Cascade-Cas3复合物在不结合目标DNA时,完全没有任何核酸酶性质,而当有正确的靶标出现,激活Cas3活性之后,会产生一个附属活性,从而可以对FQ-ssDNA探针(荧光-淬灭-单链DNA探针)进行切割,产生荧光,因此可以通过荧光的强弱即可判断是否有目标DNA。团队以此原理,开发了一套高效快速的核酸分子诊断工具,并命名为“HASTE” (heat-activated streamlined nucleic acid detection platform)。该系统可以在15分钟之内,对单分子量级的DNA完成检测,效果显著,有着与传统PCR一样可靠的精度,却极大缩短了时间和成本(下图)。
有意思的是,该项工作还发现,这个I-A系统Cas3的解旋酶活性严格依赖温度,温度越高,活性越强。因此可爱龙团队利用42度温度刺激,可以开发一套温控基因敲除工具,效率超过90%。因此,在未来,可以利用该性质,未来可以在病灶通过局部的温度刺激来调控该工具的基因编辑效率,从而最大限度地降低基因编辑工具带来的脱靶效应。
结语:分分合合的性质无关好坏,最后都能抵抗外来侵略(细菌抵抗噬菌体)完成自己种族的延续就是好的系统,type I CRISPR系统如是,人间亦如是。
相关论文信息:
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.06.007
可爱龙教授近照
可爱龙教授早年毕业于中国科学技术大学,目前于康奈尔大学任教授,获Robert J. Appel Professor荣誉头衔。主攻RNA相关领域的分子机制,包括核酶(Ribozyme)和CRISPR-Cas。在这两个领域都取得了十分喜人的成绩,最近六年发表Nature, Science, Cell论文十余篇。
可爱龙实验室目前还有三个博士后名额,分别为生物信息学,细胞生物和结构生物学方向各一名。正所谓人如其名,可爱龙教授在Ithaca(译名“绮色佳”),东山脚下,五指湖畔等着有为青年的加盟!有意者请联系ailong.ke@cornell.edu
参考文献
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