基因组中的启动子，增强子, 抑制子等顺式调控元件，通过远程的三维DNA相互作用，在细胞的转录调控中起着重要作用。这些顺式调控原件的染色质通常是开放性的，ATAC-seq可以用来捕获这些开放性的顺式调控元件在基因组中的序列，但是不能获得它们在基因组中的三维相互作用的信息。Hi-C作为研究3D基因组的“金标准”，能够全面获取基因组的三维空间信息，但无法富集顺式调控元件的序列，所以所需的测序数据量非常巨大。例如要想获得高分辨的人或者小鼠的DNA相互作用信息, 通常需要几个billion的Hi-C reads，普通的实验室很难承受的起这样的花费。

近来非常流行的HiChIP和PLAC-seq技术结合了ChIP-seq和Hi-C，可以富集一部分顺式调控元件的三维空间信息，但是这种富集仅仅局限于某一种组蛋白修饰（或者蛋白结合）的位点，不能用来研究所有开放性的染色质相关的三维结构。同时，HiChIP/PLAC-seq需要高质量的抗体，这也影响了它们应用的广泛性。

HiCAR技术首先利用Tn5转座酶将DNA接头 （adapter）插入到基因组中的开放区域（顺式调控元件区），再通过细胞核内的原位酶切和连接，将Tn5携带的DNA接头连接到空间距离相近的染色体DNA（图1A）。最终得到的文库，测序得到read2为Tn5插入的顺式调控元件区（图1B），而read1 为与顺式调控元件相互作用的序列。

图1 HiCAR实验设计和数据展示

实验结果表明read2的track与ATAC的track非常相似（图1C），通过分析read2能够捕获绝大多数的ATACseq 的peak（图1D）。仅需要500 Million reads的测序深度，HiCAR构建的三维基因组相互作用的矩阵和深度测序的Hi-C （2.53 billion reads） 构建的矩阵非常相似，并可以得到非常类似的高分辨率（5kb）的基因组相互作用的细节（图1E）。同时，HiCAR能够捕获到大多数通过其他技术捕获到的DNA相互作用（图2）。HiCAR整个建库流程简单，成本低，不需要biotin富集。由于Tn5的高灵敏度，HiCAR只需要30k-100K 左右的细胞和300 million的测序深度，就可以鉴定5kb分辨率的顺式调控元件之间的相互作用。

图2. HiCAR捕捉的顺式调控元件的远程作用于其他方法的比较

通过分析人的胚胎干细胞（H1 hESC）的HiCAR数据，作者发现了许多启动子与启动子的相互作用。根据经典的转录调控模型，启动子只负责调控其紧密相邻的基因的表达。近些年来的研究结果，包括刁亚锐在Bing Ren实验室博士后期间的工作，发现一个基因的启动子可以作为另一个基因的增强子，从而远程调控另一个基因的表达。通过HiCAR的分析，课题组发现许多没有转录活性的启动子（poised promoter）可以作为抑制子（silencer），通过远程相互作用来抑制另一个基因的表达。这个结果进一步扩展了我们对于“启动子”的远程基因转录调控功能的理解。

最后，为了验证HiCAR是否能够应用于非常少量的原代细胞或者病理组织，作者利用流式细胞仪从病人的活检组织中筛选到30K的人肌肉干细胞，用于HiCAR实验分析，并得到了高分辨率的DNA相互作用图谱。在人类干细胞中，HiCAR找到了约46K个顺式调控元件，以及26K个DNA相互作用位点，并且发现了MYF5、MYOD1（肌肉干细胞主要调节因子）的细胞类型特异的顺式作用元件。

综上所述，作者证明HiCAR确实能够利用少量的细胞、较少的测序数据量，精确的捕获高分辨率的顺式调控元件以及顺式调控元件调控的基因。杜克大学的尉晓林博士和向禹博士为本文的共同第一作者，杜克大学助理教授刁亚锐为通讯作者。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.01.023

附：杜克大学刁亚锐课题组的研究主要集中于两个方向：一，作为一个硬核基因组学实验室，通过开发新的基因组学技术，来研究基因组结构和功能对转录调控的影响。二，应用先进的基因组学和蛋白组学技术，包括单细胞多组学，时空转录组，结合小鼠模型和临床病人的组织，来研究骨骼肌再生、修复，以及肌肉相关疾病（包括衰老，横纹肌肉瘤，肌肉缺血损伤等等）过程中的转录调控。

课题组经费充足，正在招聘博士后（包括生物信息学和湿实验），欢迎对功能基因组学、干细胞和组织再生感兴趣的小伙伴加入。