纳米技术的发展有望帮助改善农作物现状，包括作物性状改进、植物病原体保护、营养和农药输送、植物和土壤健康监测以及创造具有高产量和抗压性等理想特征的作物品种。近些年，纳米材料作为一种新兴的技术手段在植物基因改造中的应用受到广泛关注，纳米材料（如层状氢氧化物纳米片、碳纳米管、DNA纳米结构等）介导的生物分子（质粒DNA、siRNA）递送也取得一系列突破性成果。2019年，张欢博士在Landry教授和上海交通大学樊春海院士合作指导下，利用框架核酸技术发现纳米结构的尺寸和刚性对其被植物细胞摄取有着重要影响（PNAS, 2019,116, 15:7543-7548）。

2019年Nature Nanotechnology杂志推出的纳米技术在农业中的应用前景和挑战专题中特意指出，纳米农业仍处于萌芽阶段，是一个机遇和挑战并存的领域，将在不久的将来迎来高速发展；如果可以恰如其分地理解纳米材料与植物之间的基本相互作用及机制，那么纳米农业未来可期。目前基于纳米材料递送生物分子植物体系的大部分研究重在评价最后功效，而忽视了纳米材料与植物组织及细胞的相互作用、纳米材料在植物中的运输、转运和摄取机制研究。

最新这项工作正是针对这一问题，选取设计了5-20 nm的球形及13x70 nm棒状金纳米颗粒，将核酸可控的修饰在表面，设计成纳米探针，并以此为模型系统研究纳米材料形貌对其与植物组织、细胞相互作用的影响（图1）。

图1，不同大小、形貌的核酸修饰的金纳米探针示意图。

作者首先利用共聚焦显微镜（Confocal）技术，采取荧光共定位的手段，追踪了Cy3修饰的金纳米探针在植物组织中的运输及其与细胞壁/膜的结合（图2a）。作者选取了mGFP烟草突变体作为模型，该植物模型中持续表达的GFP蛋白可作为一个天然的优良内参，通过统计计算Cy3与GFP荧光共定位的相对比率，我们可以从中得出纳米颗粒与细胞膜/壁的相互作用。统计比较探针与植物细胞孵育不同时间（0-24 h）后的荧光共定位比率，作者发现，金纳米探针与细胞壁/膜的结合与材料本身的尺寸和形状均有关。对于尺寸较小（5-15 nm）的球形金纳米颗粒更快的到达荧光共定位的最大值，而20 nm的球形纳米颗粒未出现最大值。棒状的金纳米颗粒出现了共定位比例的一个突跃（图2b）。

图2，利用共定位技术研究荧光（Cy3）标记的金纳米探针与mGFP烟草植物叶片及细胞的相互作用。

为了进一步追踪纳米颗粒的亚细胞定位，作者采取了具有更高分辨率的透射电子显微镜（TEM）对纳米材料处理过的叶片细胞进行了高分辨成像。如下图3所示，作者发现，所有尺寸的球形纳米颗粒均匀分布在细胞壁/膜的外围，未发现其进入植物细胞内。20 nm的球形金纳米颗粒更多的是被夹在细胞壁中间，这也暗示了尺寸较大的纳米颗粒的运输在某种程度上受其本身尺寸限制。但是，作者却发现，棒状的金纳米颗粒是可以进入植物细胞的，并且其与细胞壁/膜的作用存在不同的角度（图4a, b）。通过对棒状金纳米颗粒与细胞壁/膜的相互作用进行统计分析（图4c），作者发现棒状的金纳米颗粒进入植物细胞时存在一个角度转换过程（平行到垂直）。

为了进一步证实尺寸对于纳米材料在植物组织中运输能力的影响，作者利用同步辐射装置对10 nm，20 nm的球形及棒状的金纳米颗粒处理后的叶片中金元素的分布进行了分析。结果显示（图4d），10 nm的球形金纳米颗粒及棒状金纳米颗粒均匀的分布在叶片中，而20 nm的球形金纳米颗粒的运输则被大大限制了。后续的机理研究也证实棒状金纳米颗粒可能是通过能量依赖的内吞作用进入植物细胞。至此，作者提出了不同形状的金纳米粒子与植物细胞相互作用的模型（图4f）。

图3，不同大小的球形金纳米颗粒在植物细胞中的高分辨成像图。

图4，棒状金纳米颗粒的高分辨TEM照片（a，b）及金棒与细胞壁相互作用角度统计分析图（c）。d，同步辐射光源扫描不同大小及形状的金纳米颗粒处理叶片中金元素的分布。e，化学抑制剂研究棒状金纳米颗粒进入植物细胞的机理。f，不同大小、形状的金纳米颗粒与植物组织、细胞相互作用示意图。

最后，作者将可以抑制GFP表达的siRNA修饰在金纳米颗粒表面，比较不同形貌的纳米载体载带siRNA发挥基因沉默的功效（图5a）。作者首先证明了金纳米颗粒作为载体时可以有效地保护siRNA免于降解（图5b），其次，作者发现，修饰在金纳米载体上的siRNA可以在胞外体液中被释放出来（图5c）。作者利用RT-PCR技术和Western blot技术从mRNA水平和蛋白质水平上对载带的siRNA的功效进行了评估。结果证明10 nm球形金纳米颗粒作为siRNA载体时表现出最优的瞬时基因沉默功能，GFP的mRNA几乎可以全部被降解（＞99.9%）。相反的，能够进入植物细胞的棒状金纳米颗粒作为siRNA载体并没有表现出好的基因沉默效果（图5d）。

结合上述显微镜及成像结果，作者提出对于植物中siRNA的递送，纳米载体进入植物细胞并不是必须的，纳米载体如果可以携带并保护siRNA到达细胞壁/膜附近，siRNA在体外液的环境中被释放出来后，可以发挥更好的基因沉默功能。

图5，a, 载带了siRNA的金纳米粒子TEM照片。b，金纳米颗粒可以有效地保护siRNA免受降解；c，装载在金纳米颗粒表面的货物可以在体外液中释放；d，利用RT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上评估不同形貌的金纳米载体载带siRNA发挥基因沉默功能的差异。

该工作系统研究并阐明了纳米载体的形貌对其与植物组织及细胞相互作用的影响：纳米载体的尺寸决定了其在植物组织中的扩散及运输能力，而形状（长径比）对其细胞摄取有着关键影响；发现并证实了对于siRNA的递送，纳米载体只需保护并运送siRNA到细胞壁附近，siRNA可在细胞外体液中被释放出来进入细胞并发挥高效基因沉默功能，而无需载体本身进入植物细胞。

该工作为后续植物体系中纳米载体的设计提供了重要依据，也为后续针对不同生物功能分子的载体设计提供了思路。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41565-021-01018-8