眼球是哺乳动物感受光线并将其转化成电信号，从而参与视觉产生的器官。使用眼球石蜡切片开展分子生物学研究，目前仍然受到组织学技术瓶颈的很大限制。优化用于常规组织学、免疫荧光和单分子RNA原位杂交共染的小鼠眼球切片的组织学工艺，将促进对眼球开展分子组织学的进一步研究，为多种眼科疾病的发病机理研究提供技术支持。

图1. 使用此实验工艺获得（A）以及具有坍缩加工缺陷（B）和组织破碎加工缺陷（C）的一周龄小鼠的眼球切片（比例尺：500微米）

尽管基于眼球的外科技术已经较为发达，但人们对一系列眼科疾病的药物治疗方式乃至发病机制的了解仍然不足。在后基因组时代中，人们开始尝试从分子尺度研究这些疾病的发病机制。分子组织学在这些研究中将起到重要作用。

然而，可制备没有明显加工缺陷的眼球组织切片的组织学工艺仍鲜有报道。常见的眼球组织切片常伴有眼球坍缩和组织破碎等加工缺陷。这主要归结于眼球特殊的生理结构。眼球的中央为硬度较高的晶状体，其四周为硬度很低但所占体积较大的眼前房、玻璃体腔。外周则为连接硬度较低的神经和上皮组织。这导致了在制备眼球组织学切片的过程中，晶状体对刀片的较强的抵抗力将给其他组织带来撕扯或碎裂的加工缺陷。同时，眼前房和玻璃体腔可能在加工过程中因为渗透压的变化而发生坍缩，从而改变各眼组织的实际空间分布情况，并造成眼组织的局部扭曲。视网膜上皮层和神经细胞层的连接也较为脆弱，在加工中两个细胞层也很容易被撕裂。此外，眼球的组织切片在一些分子生物学检测操作中，极易从玻璃片上脱落。因此，眼球的组织学加工仍是组织学上的一大难题。

因此，搭建一套有效的基于眼球样本的组织学加工工艺，将有望推动人们对多种眼组织在组织学层面的研究，并可与已有的遗传学、转录组学及生物化学手段相互配合，进一步加深人们对眼球的科学认识，最终为多种眼科疾病的发病机理研究提供技术支持。

在这项研究中，研究人员通过整合和优化各环节中的关键试剂、样本处理条件和实验操作，摸索出一套有效的实验工艺。实验工艺主要分为以下几个主要环节：样品固定及准备、基于微波的石蜡浸润及包埋、石蜡块组织切片、石蜡脱除、苏木精-伊红染色、针对分子染色的切片预处理、基于ViewRNA试剂盒的单分子mRNA原位杂交及荧光标记和基于抗体的免疫荧光标记。在这套实验工艺中，mRNA分子荧光标记和蛋白分子荧光标记在同一切片上的同时标记可以实现。流程示意图如图2所示。

图2. 完整实验工艺流程示意图

研究人员对实验工艺的每个环节中的关键的步骤都进行了进一步的说明。这些关键步骤都对最后的结果有着显著的影响。

在样品准备及固定环节，研究人员指出Hartman’s固定液对保持眼球结构的保真具有重要意义。实验室常用的固定液为4%的中性多聚甲醛，以兼顾样本的形貌保持和分子标记活性。但对于眼球而言，4%的中性多聚甲醛固定无法保持眼球的形貌。组织的开裂、撕裂及视网膜上皮层和神经细胞层的滑脱等常见的加工缺陷大大影响人们对各个眼组织的形貌的观测。典型的结果即如图1C所示。而使用了Hartman’s固定液固定眼球样本，则可有效避免上述加工缺陷。

此外，“微窗”技术的使用也是十分重要的。“微窗”技术，是指在眼球角膜和视网膜上留出大小适中的微型窗口的操作，以此将眼前房和玻璃体腔与外界溶液联通，从而实现促进眼内外液体交换和压力平衡的目的。不使用“微窗”技术的眼球样本会出现眼前房和玻璃体腔几乎完全坍缩的加工缺陷。典型的结果即如图1B所示。研究人员指出，在角膜上留出1个“微窗”，视网膜上留出2个“微窗”是较为理想的条件。在适当的取向操作下，“微窗”附近的组织将会在切片过程的前期修除中除去，不会影响所获得的切片的完整性。

图3. “微窗”技术操作示意图（A）以及使用“微窗”技术前（B）和使用后（C）的2月龄小鼠眼球样本照片（比例尺：1000微米）

基于微波的石蜡渗透、石蜡块组织切片、石蜡脱除环节及苏木精-伊红染色均为常见的组织学实验操作。通过对所获得的苏木精-伊红染色切片的光学成像，研究人员证明了该切片可保持眼球自然的近圆形的切面形状的同时，还保持了角膜、虹膜、睫状体、视网膜和视神经盘等多种眼组织的精细组织形貌。

图4. 眼球切面全貌（A）以及睫状体（B）、前段视网膜（C）、虹膜括约肌（D）、中央视网膜（E）、角膜（F）、视神经（G）的形貌观测（比例尺：500微米（A）和50微米（B-G））

分子组织学染色可提供的生物学信息更多样但步骤也更为复杂。研究人员整合了热致抗原修复、基于过氧化氢的光促内源性色素漂白、蛋白酶处理及表面活性剂穿透等组织学常用的切片前处理操作，获得了可用于mRNA和蛋白质分子染色的眼球切片，同时保证了眼球切片，尤其是眼前节部分，不会显著脱离载玻片的效果。

在单分子mRNA原位杂交及荧光标记和基于抗体的免疫荧光标记部分，研究人员选择了连接蛋白43（Cx43），又名间隙连接蛋白α-1（Gja1），的mRNA和蛋白质作为目标分子。已有的报道显示，Cx43在小鼠、大鼠、兔子等动物的睫状体中均有表达，并对眼内压的调节及玻璃体腔的发育和维持有着重要作用。一系列人类的眼科疾病也与Cx43基因的突变有着较强的相关性。因此，研究Cx43在眼球中的转录、表达及细胞定位的情况将有效帮助人们对这些眼科疾病的发病机制有进一步的了解。

研究人员在本套实验工艺中给出了制备单分子mRNA原位荧光标记和免疫荧光标记共染的眼球切面的具体实验步骤，并对所获得的眼球切面进行了荧光成像，观测了在成年小鼠睫状体组织中，Cx43的mRNA和蛋白质的组织分布情况。Cx43的mRNA在睫状体的内上皮层、外上皮层及两者的结合部分均有分布，且内上皮层和外上皮层中的mRNA分子密度大致相近。但外上皮层中的Cx43的蛋白质水平则显著高于内上皮层中的Cx43蛋白质水平。可能的解释是Cx43蛋白在睫状体的两个上皮层中可能受到不同的后转录调控，从而导致了mRNA水平相近但蛋白质水平差异很大的现象。

图5. Cx43的蛋白质和mRNA在睫状体中的分布情况。蛋白质、mRNA及细胞核通道合并图（A）以及蛋白质荧光标记通道（B）、mRNA荧光标记通道（C）。D-F为A-C所标出区域的局部放大图（比例尺：50微米（A）和15微米（D））

综上所述，这套实验工艺可实现从新鲜解剖的小鼠眼球样本到可用光学显微镜进行形貌和分子染色观测的切片样本的全过程，将有望为人们从组织学层面进一步研究眼球的各个组织提供强有力的技术支持。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100879