嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法是近年来快速发展的一种新型肿瘤治疗方法。嵌合抗原受体（CAR） 是通过细胞工程手段，在T 细胞表面表达抗原受体蛋白，并能结合特定肿瘤抗原，激活T细胞的肿瘤杀伤性能，实现细胞免疫治疗的目的【1】。CAR-T 细胞免疫疗法在针对CD19⁺B细胞恶性肿瘤的治疗中取得了显著疗效，已被美国FDA和欧洲药品管理局批准用于治疗特定适应症。日前，国家药品监督管理局也已批准了两款CAR-T细胞治疗产品于国内上市。然而，作为一种新兴的肿瘤治疗手段，CAR-T细胞免疫疗法仍然受制于明显的安全性问题，这主要是由于缺乏对T 细胞活性定量、定时、定点地精准操控。例如，在半数以上接受治疗的患者中，CAR-T细胞免疫治疗会引起细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）、神经毒性或者对健康细胞存在“在靶/脱肿瘤”（on-target, off-tumor）的细胞毒性（例如，引起B 细胞发育不全 ）。因此，开发一种能够对CAR-T细胞在时间和空间上精准操控的方法，对于实现安全精准的细胞免疫治疗至关重要。

图: LiCAR-T细胞实现安全可控的细胞免疫疗法

为了实现对CAR-T细胞的时空精准操控，得州农工大学周育斌教授团队与 麻省大学医学院韩纲教授团队及得州农工大学黄韵教授团队合作，开发了一种基于纳米光遗传学技术的红外光无线操控手段，对CAR-T细胞进行可控激活，实现了安全精准的细胞免疫疗法。纳米光遗传学技术是将纳米光子学与光遗传学技术相结合，利用纳米材料作为原位光转换器，将长波长激发光转换为可激活特定离子通道的刺激，如短波长可见光或热刺激等，通过对离子通道的无线激活，引发特定细胞行为【2】。该合作研究团队在纳米光遗传学领域具有深厚的技术积累。早在2015年，该合作团队利用上转换纳米颗粒将红外光转换为蓝光，激活树突状细胞的钙离子通道，实现了对树突状细胞下游免疫反应的无线操控【3】。此后，该合作团队又相继实现了利用纳米光遗传学技术无线操控细胞坏死性凋亡和细胞焦亡用于肿瘤治疗【4】，以及纳米光遗传学技术无线操控光敏蛋白用于可控免疫治疗【5】。此前的研究为这项工作积累了可靠的技术和具有创新精神的合作团队。

图：近红外光激活的纳米光遗传学技术

在这项工作中，研究人员首先对CAR-T 细胞进行了工程化改造。研究人员将嵌合抗原受体功能区块拆分成两个模块，并在两个模块上分别安装光控组件。光控组件在蓝光激发下，将两个模块合并成一个完整的功能性嵌合抗原受体。与传统CAR-T细胞直接被特定抗原激活相比，LiCAR-T细胞与特定抗原结合后并不会被激活，而是在蓝光的激发下，可控地激活T细胞，从而实现时空精准操控的目的。研究人员尝试了两组植物来源的光控二元异聚组件（拟南芥来源的花隐色素 2 (CRY2)/CIBN组合及燕麦来源的 light-oxygen-voltage domain 2 (LOV2)-ssrA/sspB组合）。通过一系列在细胞水平对LiCAR-T细胞的光激活功能性及暗毒性的评价，研究人员最终选择了光激活效率更高、暗毒性更低的基于燕麦LOV2组件的LiCAR-T细胞。

在验证可控免疫治疗的体外实验中，研究人员利用人源外周血单核细胞 (PBMC) 的 CD8⁺T 细胞为基础，设计表达了具有光控组件的LiCAR-T细胞，并发现LiCAR-T细胞在蓝光的激活下，表现出与传统CAR-T细胞相当的对特异抗原表达的肿瘤细胞的杀伤效果。而在无蓝光照射的条件下，LiCAR-T细胞并未被激活。而对于无特异抗原表达的肿瘤细胞，无论光照与否，LiCAR-T细胞均未被激活。这些结果证实，LiCAR T 细胞能够在肿瘤抗原和光照的双重激活条件下，对肿瘤细胞产生特异且严格可控的免疫治疗反应。为了在同源小鼠肿瘤模型上验证LiCAR-T细胞的可控免疫治疗，研究人员利用小鼠的CD8⁺T 细胞为基础，设计表达了LiCAR-T细胞， 并获得了与基于人源CD8⁺T的LiCAR-T细胞一致的实验结果。

图：新型上转换纳米颗粒具有显著增强的红外光-蓝光转换能力以及生物组织穿透力（高达厘米级）

然而，单独的LiCAR-T细胞并不能直接用于对深组织肿瘤的治疗。这是由于目前的光控组件大多对蓝光等短波长可见光响应，而短波长可见光的组织穿透能力极弱（小于1-2毫米只能透过皮肤表皮层），无法从体外直接操控组织深处的光敏组件。为了解决这一普遍存在的问题，研究人员巧妙地将上转换纳米颗粒与LiCAR-T细胞结合起来，实现了无线操控的纳米光遗传学技术。上转换纳米颗粒是一类特殊的荧光纳米材料，它能在长波长近红外光的激发下产生反斯托克斯位移的短波长可见光。研究人员利用上转换纳米颗粒作为原位光转换器，将近红外激发光转换为蓝光，激活LiCAR-T细胞。这一方法解决了传统光遗传学工具受制于组织穿透深度浅的可见光激发的缺点，能够实现无线操控的纳米光遗传学技术。

研究人员首先构建了CD19阳性的B16-OVA-hCD19和CD19阴性的B16-OVA小鼠肿瘤模型。待肿瘤形成后，分别在肿瘤部位注射上转换纳米颗粒和LiCAR-T细胞。为了提高上转换纳米颗粒的发光性能，研究人员合成了高浓度Yb³⁺掺杂的大尺寸NaYbF₄:0.5%Tm@NaYF₄上转换纳米盘（底部直径约200 nm，高度约85 nm）。通过提高Yb³⁺的掺杂浓度及增加纳米颗粒尺寸，该上转换纳米盘的发光强度，相对于传统的30 nm粒径NaYF4:30%Yb,0.5%Tm@NaYF4纳米颗粒，提高了约4.5倍。研究人员利用二氧化硅包覆提高其生物相容性，并通过一系列组织切片及血液分析，验证了其在小鼠体内的生物安全性及材料稳定性。在980 nm波长的红外光照射下，该上转换纳米盘发出蓝光，原位激活LiCAR-T细胞，对小鼠CD19阳性肿瘤细胞具有高效的杀伤效果，并消除了肿瘤；而在无光照或CD19阴性的条件下，LiCAR-T细胞不具有肿瘤杀伤效果。

在瘤内注射的基础上，研究人员还研究了静脉注射LiCAR-T细胞，配合瘤内注射上转换纳米颗粒或将上转换纳米颗粒偶联至LiCAR-T细胞共同静脉注射，利用红外光可控激活免疫反应，实现了对小鼠肿瘤的有效抑制。通过对照两种注射方法，研究人员还发现，相比于分别注射的上转换纳米颗粒和LiCAR-T细胞，偶联后的上转换纳米颗粒-LiCAR-T细胞呈现出对肿瘤的更优的抑制效果。这是由于偶联后，上转换纳米颗粒与LiCAR-T细胞距离更近，能够实现更有效的近红外光无线激活。

图：静脉注射上转换纳米颗粒偶联的LiCAR-T细胞实现了利用光遗传学技术无线操控的免疫疗法对肿瘤的有效抑制

然后，研究人员验证了LiCAR-T细胞能够有效避免传统CAR-T细胞免疫疗法的副作用，特别是“在靶/脱肿瘤” （“on-target, off-tumor”）细胞毒性及细胞因子释放综合征（CRS）。在研究LiCAR T细胞的“在靶/脱肿瘤”（“on-target, off-tumor”）细胞毒性时，研究人员发现LiCAR-T细胞仅抑制CD19阳性肿瘤细胞，而对于CD19阴性肿瘤细胞无影响，这验证了其“在靶”（“on-target”）效应。而常规CAR-T细胞“脱肿瘤”（“off-tumor”）的细胞毒性常表现为引起具有CD19表达的B 细胞发育不全。为了验证LiCAR-T细胞能有效避免“脱肿瘤”细胞毒性，研究人员比较了LiCAR-T细胞/常规CAR-T细胞注射前后小鼠外周血中B细胞的数量。

结果表明，常规CAR-T细胞注射三天后，外周血中B细胞数量及B细胞百分比均有显著下降，而LiCAR-T细胞注射并未引起B细胞数量及百分比的显著变化。这些结果表明，LiCAR-T细胞能够有效避免“在靶/脱肿瘤” （“on-target, off-tumor”）的细胞毒性。在比较LiCAR-T细胞与常规CAR-T细胞引发不受控免疫反应及相关细胞因子释放综合征时，研究人员发现，注射常规CAR-T细胞三天后，CRS模型小鼠的体重明显减轻，且伴有较高的IL-6细胞因子水平；而LiCAR-T细胞能有效避免这些不良反应。这些结果证实了LiCAR-T细胞能够实现更加安全可控的细胞免疫疗法。

综上，该交叉研究利用独特的纳米光遗传学技术操控LiCAR-T细胞，实现了时空精准操控的细胞免疫疗法。同时，与上转换纳米颗粒结合使用，利用近红外光实现无线操控的深组织激活，能够避免传统光遗传学技术组织穿透能力差的缺点。上述上转换/LiCAR-T细胞免疫疗法能够有效避免传统CAR-T细胞免疫疗法中“在靶/脱肿瘤” （“on-target, off-tumor”）细胞毒性及细胞因子释放综合征（CRS）等副作用，显著提高了细胞免疫疗法的安全性。这种可远程控制的纳米光遗传学技术不仅将为研究嵌合抗原介导的抗肿瘤免疫提供独特的研究手段，还为开发智能免疫疗法以提供个性化抗癌奠定了基础。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41565-021-00982-5

黄韵课题组（https://ibt.tamu.edu/faculty/yun-nancy-huang.html）和周育斌研究组（https://yubinzhou.webs.com/）一直致力于表观遗传学、血液系统肿瘤发生、心脏发育、合成生物学、生物医学工程和光控遗传学的前沿研究。其团队在Nature及多个子刊系列杂志, Science Advances, Cell Chemical Biology, Advanced Science, 以及JACS, Angewandte Chemie, Chemical Science等顶级化学期刊发表多篇封面文章，并为Physiological Reviews, Trends series, 和Current Opinion系列杂志撰写领域内权威综述文章。课题组从事基础以及转化医学研究，已培养出独立PI若干名。课题组长期招聘博士研究生及博士后，欢迎志同道合的科研爱好者加盟或来函咨询：

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参考文献