靶向遗传筛选是揭示细菌基因型-表型之间联系和研究细菌复杂调控网络机制的关键技术。然而，目前细菌中常用的靶向遗传筛选方法，例如MAGE和TRMR，高度依赖于特殊的重组酶，只能适用于十分有限的物种中，缺乏普适性。

基于CRISPR-Cas9/Cas12a的靶向遗传筛选系统，通过利用基因组非同源末端连接修复机制，能够在真核细胞中实现高效的靶向遗传失活筛选。然而，多数细菌中缺乏高效的非同源末端连接修复机制，因而CRISPR-Cas9/Cas12a不能应用于细菌中靶向遗传失活筛选。因此，亟需在细菌中开发普适性的靶向遗传筛选系统。

CRISPR-Cas12k引导的转座酶系统是一种由Cas12k、sgRNA、TniQ/TnsBC转座酶构成的定向转座系统。利用Cas12k/gRNA复合物的基因组识别和定位功能， TniQ/TnsBC能够实现细菌基因组的定向转座。研究人员发现，尽管CRISPR-Cas12k引导的转座酶系统（ShCAST）能够实现铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的定向转座，但是其效率往往较低，无法实现高通量定向转座和筛选。通过引入抗生素和蔗糖的双重筛选策略，研究人员高效富集了正确转座的突变菌株，利于后续大规模靶向转座文库构建。

图1. 细菌中STAGE文库构建策略与系统评价。

通过利用DNA高通量合成，研究人员构建了针对铜绿假单胞菌所有转录因子的STAGE文库。研究人员进一步通过定量扩增子测序策略，评估了构建的STAGE菌株库的质量，发现大多数转座插入事件发生在识别位点下游的60-70个碱基对，与大肠杆菌中ShCAST系统的插入模式一致。此外，研究人员还观察到5bp重复插入事件，这是Tn7转座产物的标志性特征。而在整个基因组中插入事件中，发现约93%的读数位于目标位点附近。对NGS数据的进一步分析显示，92.9%的spacer序列识别位点下游存在插入事件，且覆盖了98.48%的靶基因。未检测到所有针对10个必需基因（阴性对照）的插入事件。这些结果表明，ShCAST介导的转座子筛选文库可以用于细菌大规模靶向文库构建。

之后研究人员利用铜绿假单胞菌转录因子STAGE文库，筛选了铜绿假单胞菌抗生素耐药性的基因和相关途径。暴露于亚致死水平的抗生素会导致细菌生长的分化，从而使耐药突变体在培养过程中富集，而抗生素敏感突变体逐渐被消除。通过对药物处理前后不同sgRNA介导的插入事件数量的统计，研究人员分别鉴定到了不同的耐药/敏感基因。为了验证从STAGE文库中鉴定出的基因在抗生素耐药性中的作用，研究人员使用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术重建了可信的突变体，药物筛选的结果与STAGE突变文库鉴定的结果一致。这些发现表明STAGE方法是一种有效且可靠的工具，可用于基因型-表型关系的高通量分析。

综上所述，研究人员开发了STAGE方法，这是一种使用Cas12k引导的转座酶在不同微生物物种中进行高通量位点特异性基因组工程的方法。除基因定点失活外，STAGE还可用于将功能基因组元件高通量地整合到不同微生物物种的目标基因组位点中，这是以往依赖同源重组或随机转座子诱变的方法难以实现的。此外STAGE方法也可用于混合细菌群落中的多重基因破坏和物种特异性遗传操作。

上海科技大学物质学院副研究员陈未中和中山大学博士生任泽慧为本文的共同第一作者，上海科技大学季泉江教授和中山大学骆观正教授为本文的共同通讯作者。该工作得到国家自然科学基金、科技部重点研发计划、上海市自然科学基金、广东省自然科学基金、广州实验室应急项目的支持。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109635