木质素是植物细胞壁结构成分之一，它通过加强细胞壁的机械强度和防水性使植物能够适应多变的环境。植物木质素具有很强的可塑性，多种修饰的木质素天然存在于植物当中。自上世纪50年代始人们就已发现包括杨树在内的多种物种中的木质素会发生对羟基苯甲酸酯修饰（p-hydroxybenzoylation），但是该修饰的催化分子机制一直不清楚。

木质素除了可以被对羟基苯甲酸酯修饰以外，还可以有多种其它酰基修饰，如香豆酸酯（p-coumarate）、阿魏酸酯（ferulate）、乙酸酯（acetate）、苯甲酸酯（benzoate）、香草酸酯（vanilate）等。其中负责木质素香豆酸酯和阿魏酸酯修饰的酰基转移酶近年来已在一些物种中被发现、鉴定，而这些鉴定的木质素单体酰基转移酶无一例外的属于所谓的“BAHD家族”酰基转移酶。BAHD酰基转移酶家族是由数量众多的植物特异的酰基辅酶A依赖的酰基转移酶组成。这些酶的一级序列保守性很低，氨基酸相似性只有10-30%，酶功能差异性很大。

美国能源部布鲁克海文国家实验室刘长军研究员领导的团队早在15年前就开始聚焦杨树中BAHD家族酰基转移酶的功能鉴定。在刘长军研究员的指导下，团队成员从毛果杨基因组中鉴定出94个BAHD酰基转移酶，并通过基因表达分析锁定其中20个在杨树木质部表达的基因为潜在的木质素酰基转移酶。进一步对这些候选基因的体外酶活性进行系统筛选，发现其中一个命名为PtACT54的基因编码的蛋白具有催化修饰木质素单体的功能。

随后，团队对该酶的体外酶活性进行了详尽的分析，发现该酶只可以利用对羟基苯甲酰辅酶A、苯甲酰辅酶A以及乙酰辅酶A作为硫酯供体，利用芥子醇和松柏醇木质素单体作为受体（见图1）。酶促动力学分析发现，该酶对于芥子醇的催化效率远高于松柏醇，而在这些可以催化的硫酯供体中，该酶对于对羟基苯甲酰辅酶A的催化效率最高，因此该酶被命名为对羟基苯甲酰辅酶A：木质素单体对羟基苯甲酰转移酶（p-hydroxybenzoyl CoA: monolignol p-hydroxybenzoyltransferase 1，PHBMT1）。

另外团队还发现该酶对于苯甲酰辅酶A以及乙酰辅酶A具有独特的S型动力学行为特征，暗示该酶在苯甲酰辅酶A 或乙酰辅酶A底物浓度较低时不具备催化能力，这也许为植物体内木质素不同酰基化修饰提供了一个调控的靶点。

图1：PHBMT1参与木质素单体酰化反应示意图

一般BAHD家族酰基转移酶的体外酶活不具有很强的专一性，同时在杨树中有许多密切同源基因存在，其体外所测得的酶活性不一定与其在植物中所发挥的生物功能一致，这给准确鉴定PHBMT1体内功能增加了很大的挑战。为了解决这个问题，团队近十年来采用了多种基因工程策略来在模式植物拟南芥、烟草以及杨树体内调控该基因的表达。最终借助于杨树基因组学及CRISPR-CAS9技术的发展和运用，团队成功在杨树中将PHBMT1特异敲除，没有影响其同源基因（图2A）。

随后对于该突变体进行系统的细胞壁组分分析发现，在PHBMT1敲除的杨树树干中几乎检测不到细胞壁中的对羟基苯甲酸酯（图2B）。相反与对照相比，在PHBMT1过量表达的杨树树干木质素中，其对羟基苯甲酸酯的含量增加了48%，且这些对羟基苯甲酸酯的修饰发生在S 型木质素（来源于芥子醇单体）。至此体外生化证据与体内遗传证据一致显示PHBMT1是杨树中主要的负责木质素对羟基苯甲酸酯修饰的酰基转移酶。

图2：Crispr-Cas9 特异敲除杨树中PHBMT1基因造成树干细胞壁中的对羟基苯甲酸酯（pBA）不能积累

虽然木质素酰基化修饰的现象广泛存在于不同植物物种中， 但其生物学意义仍然是一个未解之谜。该文发现降低木质素对羟基苯甲酸酯修饰可显著提高木质素聚合物的溶剂溶解率，表明对羟基苯甲酸酯修饰可改变木质素的结构和物理化学特性。木质素对羟基苯甲酸酯修饰特异的发生在S木质素上，也暗示了它会参与S-型木质素积累的一些特定植物生理过程。

对羟基苯甲酸是一种重要的化工原料。作为防腐成分（preservatives）被广泛应用于食品、医药和化工产品中， 同时也是合成耐热型塑料的原材料。该文发现通过木质部表达的启动子驱动PHBMT1基因在杨树中表达，可以使杨树细胞壁中积累更多的酯酰键连接的对羟基苯甲酸酯，而这些细胞壁中富集的对羟基苯甲酸易于提取，有望成为可持续再生的重要工业原料。因此，PHBMT1的鉴定不但为植物基因工程进行生物质改良提供了重要的靶点，同时也为合成生物学利用植物平台生产高附加值的化合物提供了重要的分子工具。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41477-021-00975-1