DNA双链断裂修复对于基因组稳定性的维持非常重要。DNA双链断裂修复主要通过非同源末端连接（Non-homologous End Joining, NHEJ）和同源重组（Homologous Recombination, HR）来完成，其中NHEJ容易出错并引入突变而HR具有高度的精确性，因此HR对基因组稳定性的维持尤为重要。

近期研究通过检测HR核心蛋白RAD51在损伤位点的聚集发现转录活跃区域内的DNA双链断裂有更强招募RAD51的能力, 由此推论HR在基因转录活跃区有更高的活力，但是其背后的具体机制并不清楚。

为了研究基因转录对DNA双链断裂修复的调控机制，作者基于经典的HR检测系统DR-GFP构建了转录可诱导的Tet-DR-GFP检测系统。与DR-GFP不同，通过Doxycycline来控制Tet-On 启动子的激活， Tet-DR-GFP可以分别检测转录活跃和静默情况下的HR修复效率。更重要的是Tet-DR-GFP系统可以通过实时PCR检测修复产物，而不再依赖于绿色荧光蛋白的表达（图1）。这些重要的改进使Tet-DR-GFP成为第一种可以用于研究基因转录如何在原位影响HR的检测系统。

图1

利用这套Tet-DR-GFP系统，作者定量分析了同一个DNA双链断裂位点在转录活跃和转录静默情况下的HR修复效率，发现在转录活跃时，HR修复效率提高了70%。另外利用失去剪切活性的Cas9/CRISPR介导的RNA锚定系统，作者又发现，如果将一段与断裂位点同源的RNA序列锚定到断裂位点附近，即便断裂位点所在的GFP基因没有转录，HR修复也能达到与转录活跃情况下几乎等同的效率。这表明转录活跃区域的高效率HR修复很可能是由转录过程中产生的RNA分子引起的。

接下来，作者发现大多数参与HR的蛋白质对于转录静默或活跃条件下的HR修复具有同等程度的影响，而有趣的是RAD51的相互作用蛋白RAD51AP1只在转录活跃情况下促进HR修复。进一步的研究表明，RNA锚定所带来的HR修复效率的提高也依赖于RAD51AP1。

鉴于RAD51AP1本身具有RNA结合能力，作者大胆推测在转录活跃区域的HR修复过程中，RAD51AP1可能通过介导RNA分子与模板双链DNA形成R-loop结构，来促进HR的发生。通过对Tet-DR-GFP报告系统和内源DNA双链断裂位点进行DNA-RNA免疫沉降（DNA-RNA immunoprecipitation, DRIP）分析，作者发现在DNA双链断裂修复的过程中的确会形成R-loop这一结构，而且这些R-loop的形成大部分依赖于RAD51AP1。利用纯化的RAD51AP1蛋白，作者成功地在体外重构了R-loop形成的生化反应。综合生化试验和细胞内试验，作者得出结论：RAD51AP1可以催化RNA分子侵入双链DNA分子，形成R-loop结构。

作者在用Tet-DR-GFP检测R-loop形成时，发现 R-loop不仅仅形成于断裂位点附近，也形成于作为HR修复模板的iGFP位点内。这一结果大大出乎意料，因为在Tet-DR-GFP报告系统里，DNA双链断裂被诱导于sceGFP中， 而iGFP在修复中只被用作模板，iGFP既不被诱导断裂也不会被转录。也就是说，在iGFP位点内形成的R-loop结构里，其中的RNA分子只能是来自于sceGFP位点的转录本。在经典的D-loop结构中，侵入到模板iGFP双链DNA里的单链DNA分子也来自sceGFP。综合二者可以推论出：在HR修复过程中，模板DNA上不但形成了D-loop结构，而且也形成了R-loop结构。作者将此结构命名为DR-loop。

利用不同荧光标记的DNA单链分子和RNA分子，作者成功地在体外生化试验中重构了D-loop和R-loop复合物可在同一个双链DNA分子中共同存在的这一结构中间体， 证明了DR-loop可以在体外存在（图2）。鉴于R-loop的形成会使同源DNA中的模版序列成为单链，作者由此推测R-loop的形成会提高D-loop形成的效率。这一假说确实也在体外生化试验中得到了验证。

图2

基于以上结果，作者提出了全新的HR模型：在转录活跃区域的HR修复过程中，RNA分子在DNA断裂应答过程中由于RNA聚合酶II的停滞而滞留在损伤位点附近，RNA分子通过RAD51AP1的介导，与姐妹染色体同源序列配对形成R-loop结构，R-loop通过提高D-loop的形成效率（也可能会影响D-loop的稳定性或者D-loop内单链DNA的延伸），在此过程中形成DR-loop这一中间结构，并在整体上提高HR修复的效率（图3）。这个新的HR模型为以后研究基因转录和RNA在HR中的作用提供了重要的理论基础和崭新的方向。

图3

麻省总医院癌症中心/哈佛医学院邹力(Lee Zou)教授和欧阳剑(Jian Ouyang)博士为该论文的共同通讯作者，欧阳剑博士和Tribhuwan Yadav博士为共同第一作者。麻省总医院癌症中心的杨海波博士、Esther Rheinbay 博士、郭红山博士、Li Lan 教授、Daniel A. Haber 教授参与该工作的完成。

同济大学的张家民研究员也参与了该工作的完成，张家民研究员在肿瘤细胞的端粒维持和DNA损伤修复方面做出了一系列的工作，目前正在组建实验室，欢迎有兴趣的学生和同道联系合作交流（邮箱：zhangjiamin@tongji.edu.cn）

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03538-8