神经元作为一类高度特化的细胞，形成树突和轴突。神经元胞体中的mRNA可以运输至树突和轴突，并通过局部翻译来参于调控神经元的发育和神经环路的建立。课题组前期的工作发现轴突中富集microRNA （miRNA）并通过调控轴突中的局部翻译参与轴突延伸（Wang et al.,Cell Reports, 2015; Wang & Bao, Journal of Molecular Cell Biology, 2017）, 提示非编码RNA在轴突发育中发挥重要功能。已有的研究显示，lincRNA在神经系统的发育早期高表达而且具有很高的组织分布特异性，但对神经元轴突中lincRNA的分布、功能和作用机制知之甚少。

图一 轴突富集lincRNA ALAE 调控DRG神经元轴突延伸。

本研究首先通过对背根神经节（DRG）神经元进行RNA测序并建立lincRNA表达谱，结合微流小室分隔培养系统发现lincRNA MSTRG.12592在轴突中的丰度和富集程度最高（图一）。我们将其命名为ALAE，意为轴突延伸相关的轴突富集lincRNA（Axon-enriched LincRNA Related to Axon Elongation, ALAE）。通过单分子原位杂交和核质分离发现ALAE在神经元细胞质和轴突中相对富集。同时，DRG发育谱显示ALAE在发育早期高表达。进一步在微流小室培养的DRG神经元中，轴突侧选择敲减ALAE显著抑制轴突延伸，表明轴突富集ALAE参与调控DRG神经元轴突发育。

图二 ALAE与KHSPR在DRG神经元中相互作用。

进一步利用RNA 捕获蛋白技术（RNA pull-down）结合蛋白质谱分析，发现 ALAE与KH型剪切调控蛋白（KHSRP）相互作用 （图二）。通过筛查ALAE与KHSRP的结合区域，发现ALAE318-351的AU富集元件（ARE）介导ALAE和KSHRP的相互作用。

图三 ALAE调控神经元轴突侧GAP43蛋白局部翻译。

之前的研究发现KHSRP通过调控GAP43蛋白参与神经发育，提示ALAE可能会调控GAP43的表达。在微流小室培养的DRG神经元中，分别通过AAV病毒在神经元胞体感染以及siRNA在轴突侧转染的方式，发现敲减ALAE可以调控轴突中GAP43的蛋白水平而不影响mRNA水平（图三）。进一步利用Puro-PLA方法显示敲减ALAE能够显著抑制GAP43在轴突侧的翻译。以上结果表明ALAE能够调控轴突中GAP43的局部翻译。

 图四 ALAE作为“诱饵”分子竞争KHSRP与Gap43 mRNA的结合。

通过缺失KHSRP负责与RNA结合的结构域，发现KH3-4区域的缺失能同时降低其与ALAE和Gap43 mRNA的结合效率（图四）。进一步的研究发现，敲减 ALAE能够增加KHSRP与Gap43 mRNA结合，而过表达ALAE则降低KHSRP与Gap43的结合，证明ALAE与Gap43 mRNA在结合KHSRP上存在竞争关系。在培养的DRG神经元中，敲减ALAE导致轴突中KHSRP与Gap43 mRNA的共定位显著增加，表明ALAE作为“诱饵”分子参与KHSRP对GAP43的调控。

 图五  阻断ALAE与KHSRP相互作用抑制GAP43局部翻译以及轴突延伸。

最后，在培养的DRG神经元中，通过利用LNA修饰的ALAE 318-351反义链将 ALAE上的ARE元件封闭，干扰ALAE与KHSRP的相互作用，发现KHSRP与Gap43 mRNA的结合显著增加，进而导致GAP43翻译和蛋白水平下降（图五）。进一步在DRG神经元轴突中干扰ALAE与KHSRP的相互作用，导致GAP43蛋白水平显著下降以及轴突延伸受到抑制（图五）。以上结果表明ALAE与KHSRP的相互作用参与调控轴突GAP43局部翻译以及轴突发育。

 图六 轴突富集lincRNA ALAE通过竞争KHSRP参与调控mRNA局部翻译和轴突发育分子机制。

综上所述，ALAE在神经元轴突中与Gap43 mRNA竞争结合KHSRP蛋白，促使Gap43 mRNA从KHSRP抑制复合体中释放，通过增加GAP43的局部翻译上调其蛋白水平，从而促进轴突生长（图六）。本研究首次发现轴突富集lncRNA可以作为轴突发育重要的调节分子参与mRNA时空调控，同时加深对非编码RNA功能和机制的理解，为神经系统发育提供了新的分子机制。

这项工作得到了中科院营养与健康研究所杨力研究员、分子细胞卓越中心程红研究员、南方科技大学蒋兴宇研究员和中科院上海高等研究院张旭研究员的大力支持。该工作得到了国家基金委、中科院先导项目、上海科委以及中科院青年创新促进委员会的资助。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109053