哺乳动物单倍体细胞只拥有一套染色体组，在遗传筛选和转基因动物培育中具有重要的价值。目前学界已经获得了多种哺乳动物的haESCs[1-3]，但是在haESC培养传代过程中，有一定比例的单倍体细胞会自发转变为二倍体细胞，因此，研究细胞染色体倍性相关基因是一个有趣的科学问题，而且可以大大减少haESC培养中进行流式细胞分选的次数，节省人力物力。

为了解决这个问题，黄粤课题组将基于piggyBac（PB）转座子的插入基因突变载体导入到小鼠haESC中，构建了一个全基因组范围的纯合突变体文库[4]。通过多轮流式分选富集单倍体细胞后，提取基因组并进行二代测序，发现Etl4基因突变体在细胞群体中明显富集。

随后，在另外两株haESCs系中，用CRISPR/Cas9技术敲除Etl4基因后，发现它们的自发二倍化速率均明显下降，其多能性和自我更新能力则不受影响，表明Etl4的缺失可以帮助维持haESCs的单倍体状态，并且没有细胞系特异性。

为探究Etl4缺失促进haESCs维持单倍体状态的机制，研究人员通过转录组RNA-Seq分析发现Etl4缺失使得细胞能量代谢相关基因表达水平发生显著变化，进而通过Seahorse代谢实验也验证了其OXPHOS水平上升、糖酵解水平下降的特殊能量代谢表型。随后，研究人员尝试在细胞培养过程中通过改变能量代谢状态来维持haESCs的单倍体状态，发现添加促进OXPHOS的药物1,25-羟基维生素D3（1,25(OH)2D3），或者抑制糖酵解的药物三溴丙酮酸（3-BrPA），均可以让多株haESCs的单倍体细胞比例在较长时间内维持较高水平。

该研究揭示了haESCs的自发二倍化与细胞能量代谢存在关联，建立了一种通过调节培养基成分维持单倍体的方法，也为其它物种haESCs培养提供了新的思路。

通过构建突变体文库进行遗传筛选获得候选基因Etl4，功能实验表明Etl4-KO细胞系可以长期维持较高比例的单倍体状态。通过转录组RNA-Seq分析和Seahorse代谢水平检测发现其氧化磷酸化（OXPHOS）水平上升，糖酵解水平下降。进而通过在细胞培养基中加入OXPHOS的激活剂或糖酵解的抑制剂，均可显著提高单倍体细胞的比例。

中国医学科学院-北京协和医学院基础医学研究所、医学分子生物学国家重点实验室黄粤研究员、刘光副研究员为该论文的共同通讯作者；博士生张国中、李晓文为该论文共同第一作者，直博生孙艺也做出较多贡献。此研究获中国医学科学院医学与健康科技创新工程基金（2016-I2M-3-002）、国家重点研发计划“干细胞与转化研究”专项（2016YFA0100103）、国家自然科学基金项目（31671410 和31970813）资助。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2020.11.016 

参考文献

[1] Leeb M, Wutz A. Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos[J]. Nature, 2011, 479: 131-134.

[2] Yang H, Liu Z, Ma Y, et al. Generation of haploid embryonic stem cells from Macaca fascicularis monkey parthenotes[J]. Cell Res, 2013, 23: 1187-1200.

[3] Sagi I, Chia G, Golan-Lev T, et al. Derivation and differentiation of haploid human embryonic stem cells[J]. Nature, 2016, 532: 107-111.

[4] Liu G, Wang X, Liu Y, et al. Arrayed mutant haploid embryonic stem cell libraries facilitate phenotype-driven genetic screens[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45: e180.