本课题为国内多个GPCR领域前沿课题组自主联合攻关的结果，为全华班。孙金鹏教授，张岩教授和徐华强研究员为该论文的共同通讯作者；山东大学博士生平玉奇、浙江大学毛春友博士、山东大学肖鹏副教授、硕士生赵儒嘉和上海药物所蒋轶研究员为该论文的共同第一作者。山东大学易凡教授和于晓教授为本文的共同作者。

糖皮质激素（Glucocorticoid）是肾上腺皮质分泌的一类甾体类激素，在生长发育，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，同时也是临床上应用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。

1950年，Philip Hench, Edward Calvin Kendall和Tadeus Reichstein因糖皮质激素的发现以及在治疗风湿性疾病方面的应用获得诺贝尔生理及医学奖。大量的研究显示，糖皮质激素主要是通过与其核受体（Glucocorticoid receptor，GR）结合，并穿过核孔，在细胞核内调控相关基因的表达而发挥作用，这种作用方式一般需要较长的时间才能起作用，被称为基因组机制。徐华强研究员课题组分别在2002年和2014年发表了糖皮质激素核受体（GR）与地塞米松（Dexamethasone）的晶体结构 （CELL, 110：93-105）以及内源性激素-氢化可的松（cortisol）的复合物晶体结构 （Cell Research: 24:713–726(2014))。

而中科院院士、神经生理学家陈宜张先生，早在20世纪80年代便发现，糖皮质激素能够在2分钟内使豚鼠神经节神经元（ganglion neurons）发生膜电位超极化，也能在PC12细胞中快速的抑制nicotine引起的钙离子流[5-8]。这些研究提示我们，生物体内可能存在着糖皮质激素的膜受体，它们能够介导糖皮质激素的快速反应。

另外，有研究发现糖皮质激素的快速反应与G蛋白有密切关系，Gi的抑制剂PTX能够抑制糖皮质激素的快速作用，因此，研究人员推测，糖皮质激素的膜受体很可能是GPCR。然而，这四十年以来，糖皮质激素的膜受体一直未能真正确证，糖皮质激素的快速作用的机制依然成谜。

G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR）在人体内有800多个成员，是重要的药物靶点，目前临床上处方药物有33%是直接靶向GPCR的，因此一直是药物研发的热点靶标分子。GPCR可以分为6个大的亚家族，每个亚家族除了具有7次跨膜核心（7TM）这一基本结构特点之外，均具有一些拓扑结构或者功能上的特征。

其中，粘附类GPCR (Adhesion G Protein coupled receptor, aGPCR)亚家族最明显的特征是它们具有相对较长的N端胞外区域，并且存在具有不同功能的结构域。aGPCRs在生物体许多重要的生理病理过程中发挥了关键的调控作用，比如炎症反应、神经系统发育、水盐平衡调节以及细胞命运决定等。

很多粘附类受体的突变与人类的疾病密切相关，比如VLGR1的突变和耳聋密切相关，而GPR64的突变和男性不育相关，但这些突变如何导致人类疾病，是否可以针对这些粘附类受体开发出相应的药物尚不清楚。并且，与其他GPCR亚家族不同，关于aGPCR家族成员的研究相对较少，并且大部分粘附受体都是孤儿受体，他们内源性的配体并不清楚。

目前领域里普遍认为aGPCR通过结合胞外的基质蛋白，或者可溶性小分子被激活，然而是否有小分子配体直接可以直接激活7次跨膜核心尚不清楚。

孙金鹏教授团队在粘附类受体领域已经有了相当多的积累。“我们从2011年开始对听觉和生殖相关的重要孤儿粘附类受体进行研究。我们发现听力相关的粘附类受体VLGR1 (GPR98) 6236位移码突变使受体丧失结合具有Gi通路活性的PDZ7的能力，进而导致VLGR1下游Gi通路持续激活，是导致听觉失常的重要原因。当时我们的这项工作正在整理结果的阶段，突然有关于这个受体功能的类似工作以非常快的速度发表在了PNAS上，而我们也只好把部分整理的结果提前发表，这部分工作最终2014年发表在JBC上”，孙金鹏教授说。

此外，孙金鹏教授课题组还长期关注了另外一个孤儿粘附受体GPR64。他说：“2016年，我们课题组鉴定出了GPR64够激活下游收效应器分子，发现GPR64能够通过Gq和β-arrestin-1介导的机制偶联CFTR以调节输出小管离子/水稳态，从而调节男性的生育能力，最终这项研究工作在两年后的2018发表在eLife上，并获得了Faculty 1000的评论”。

除了以上两个受体之外，孙金鹏课题组还与易凡教授课题组合作发现Gpr97缺失抑制HuR蛋白表达，导致Sema3A mRNA稳定性降低以及Sema3A蛋白表达降低，从而缓解IRI引起的肾功能损伤。“我们最近在探讨了GPR97在肾脏中的功能后，发现这个孤儿受体的内源性配体，成为当务之急，也为后来配体发现和结构研究开了个好头”，孙金鹏教授表示，这项研究也为孙金鹏教授继续以GPR97为靶点，发现鉴定其内源配体，并联合张岩教授和徐华强研究院团队解析GRP97复合物的结构奠定了基础。

在进一步寻找GPR97的内源性配体的过程中，研究团队注意到治疗哮喘药物丙酸倍氯米松（BDP）能够在体外激活GPR97。通过结构观察，发现BDP是糖皮质激素类药物倍氯米松（BCM）的衍生物，在17和21位有两个丙酸的修饰。这两个丙酸的修饰在激活GPR97过程中是否必须，前期的文章中并没有给予说明。于是团队怀疑两个丙酸的修饰可能不是必须的，而BCM以及其他的糖皮质激素类化合物都可能是GPR97的配体。

接下来，研究团队对内源性的类固醇激素进行了系统的筛选，最终发现糖皮质激素类的氢化可的松 (cortisol)、可的松（cortisone）以及11-脱氧皮质醇（11-deoxycortisol）都能够激活GPR97。此外，地塞米松具有更强的GPR97激活能力。进一步的实验显示，氢化可的松和可的松都能够通过GPR97明显抑制forskolin诱导的cAMP上升。而通过Gqo解离实验确认配体作用于GPR97后最终激活了Go信号通路。

紧接着，该团队采用单颗粒冷冻电镜分别对外源配体倍氯米松（BCM）以及内源性配体氢化可的松（cortisol）激活GPR97后形成的复合物进行了结构重塑，最终解析了GPR97在配体激活情况下与G蛋白的复合物结构。其中倍氯米松与GPR97-Go复合物结构的分辨率为3.1Å，氢化可的松与GPR97-Go复合物结构的分辨率达到了2.9 Å，如图1所示。

图1

从电镜结果中可以发现，与其他已经解析的GPCR结构相比，GPR97的七次跨膜螺旋呈现独特的空间分布，其螺旋的长度与其他受体也有很大的不同；在结构中看到糖皮质激素结合到了GPR97七次跨膜正构结合位点口袋（orthosteric binding pocket）中， 配体结合口袋狭长，呈椭球形，主要通过疏水作用力和氢键与受体结合；

GPR97激活机制比较特殊，和classA 家族受体相比，没有保守的PIF motif、 DRY motif和NPxxY motif, GPR97首先通过toggle switch W6.53 识别配体，激活的受体借助新发现的upper Quaternary core（UQC） 将受体TM3-TM5-TM6捆绑在一起，然后通过HLY motif 介导与G蛋白结合。从胞内侧看，受体七次跨膜螺旋组成较大的张开口袋，3个胞内环都参与了受体与G蛋白的相互作用，胞内环与受体的组成性激活非常相关，某些重要氨基酸突变，能显著改变受体的自激活能力。

图2 Go棕榈酰化修饰

不仅如此，电镜结构还发现在Gαo的α5 helix C351位点处存在棕榈酰化修饰（图2），这是GPR97-Go 复合物中特有的，在其他已有结构的GPCR-Gi/Go 复合物中未发现此修饰，以与Gi结合的D2R（多巴胺受体）为对照，将Gα C351位氨基酸突变， 结果发现突变只影响GPR97与G蛋白偶联，不影响多巴胺受体与G蛋白偶联.。

孙金鹏教授表示，这项工作是与浙江大学张岩教授及上海药物所徐华强教授三个课题组精诚合作，全力攻关，并在山东大学易凡教授团队和于晓教授团队的协助下才顺利完成的。该成果无论是对于糖皮质激素膜受体功能研究还是黏附类GPCR的激活机制理解都起到了很重要的推动和示范作用。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-03083-w