Sirtuins是NAD +依赖性脱乙酰基酶和ADP-核糖基转移酶在进化上保守的家族，在广泛的生物活性中起重要作用。在哺乳动物的sirtuins中，SIRT1是最受关注的成员之一，并且它是多种细胞和机体过程的调节剂，包括新陈代谢，免疫应答和衰老[1]。酵母中SIRT1同源物Sir2的水平在复制性老化后下降，这是酵母老化的原因之一[2]。然而，在哺乳动物衰老过程中SIRT1蛋白稳态的调节机制仍不清楚。由于SIRT1功能的重要性，之前研究多集中于提高SIRT1的催化活性，但对SIRT1在蛋白质水平上的稳态却知之甚少。 2020年9月28日，来自美国宾夕法尼亚大学的Shelley Berger课题组和哈佛大学Zhixun Dou课题组在Nature Cell Biology杂志上发表了题为“SIRT1 is downregulated by autophagy in senescence and ageing”的研究文章，揭示了调控核内SIRT1蛋白通过自噬降解的机制，并提出了稳定SIRT1促进生产老化的潜在策略。
作者首先研究了哺乳动物衰老和老化中的SIRT1动态平衡。细胞衰老(senescence)是一种由端粒缩短或细胞应激诱导的细胞周期停滞的稳定状态。老化的组织通常以衰老细胞的累积为特征。清除衰老细胞可延缓与年龄有关的病理学，这表明细胞衰老与机体衰老之间存在关键联系。作者发现在多种衰老细胞模型中SIRT1蛋白水平均随着衰老过程逐渐降低，相反，SIRT1蛋白的水平在接触抑制诱导的静息状态（quiescence）下保持不变，这表明SIRT1蛋白在细胞衰老过程中的丢失是特异的。 虽然在细胞衰老过程中，SIRT1的蛋白水平降低，但相应的mRNA的水平并未降低。这表明除了调节mRNA合成或稳定性外，其他机制还主要参与细胞衰老过程中SIRT1蛋白稳态的调节。于是作者进一步探究在蛋白水平的调控机制，发现SIRT1蛋白的下调并不是通过蛋白酶体介导的降解，而是通过溶酶体降解。
自噬是一种膜运输依赖的途径，通过自噬体和溶酶体降解细胞成分。之前的研究主要集中在自噬对细胞质内成分的降解，但对自噬在细胞核内的作用机制的探索较少。作者发现在细胞和机体衰老过程中哺乳动物SIRT1蛋白的下调是通过SIRT1与自噬蛋白LC3的相互作用，并进一步通过细胞质自噬体-溶酶体降解。免疫荧光染色显示，尽管SIRT1主要位于增殖细胞核中，但在衰老细胞中观察到细胞质SIRT1 puncta，并且细胞质SIRT1 puncta 与LC3共定位。LC3是识别和将底物转运至自噬体所需的自噬蛋白。 然后，作者构建了mCherry-GFP-SIRT1载体来研究SIRT1的自噬运输。由于GFP对低pH值敏感，因此标记蛋白中mCherry信号代表了在酸性自溶酶体和溶酶体中的定位。在增殖细胞中表达的mCherry-GFP-SIRT1主要是核定位，并带有双色合并后显示的黄色。相比之下，衰老细胞则显示出仅与LC3或LAMP1共定位的胞浆红色SIRT1 puncta（图1）。用Lys05中和溶酶体pH可以防止衰老细胞中mCherry-GFP-SIRT1蛋白从GFP淬灭，并导致其融合的黄色信号保留在细胞质中，进一步表明溶酶体靶向细胞质SIRT1降解。总之，这些结果表明，核SIRT1在细胞衰老过程中经历了细胞质自噬-溶酶体降解。 接下来，作者研究了SIRT1中与LC3相互作用的区域，首先使用一种肽阵列（peptide array）方法在SIRT1中鉴定了可能与LC3相关的八个区域。为了缩小关键目标，作者通过将大约30个氨基酸的合成肽添加到SIRT1-LC3的 IP分析中进行了肽竞争IP，从而确定了三个目标LIR / LIR样基序（图2）。 图 2 肽阵列鉴定SIRT1-LC3相互作用区域。
作者进一步在全长SIRT1中替换了三个LIR / LIR样基序的各个关键残基，并在LC3和全长SIRT1突变体之间进行了IP ，发现了W221A和V224A双重突变导致了与LC3的相互作用减弱，而其他两个基序-F474A，D475A和V476A三重突变以及Y497A和L500A双突变不影响LC3结合。关键的LIR基序（221–224）位于SIRT1的N端区域，该基序的N末端残基突变体E214，D216和D217也损害了LC3结合。此外，在跨越氨基酸位置205-233的合成肽上引入WV突变显示出与全长SIRT1-LC3相互作用竞争的能力受损。这些结果表明，SIRT1上的221-224区对于SIRT1-LC3的相互作用至关重要。 为了检验这个通路的生理意义，作者通过体内实验表明在衰老过程中自噬-溶酶体途径会导致与免疫和造血系统相关的多种组织SIRT1的丧失，这些组织包括小鼠脾脏，胸腺，造血干细胞和祖细胞以及老年人类来源的CD8 + CD28 - T 细胞。 因此，SIRT1蛋白水平的恢复可能提供了延缓免疫老化和衰老的关键手段，为潜在的治疗干预提供了新思路。另外，稳定SIRT1蛋白水平（例如通过中断SIRT1-LC3相互作用）可能是抗衰老化合物设计的新方向。 除了核纤层蛋白B1 （Lamin B1）[3]，SIRT1是目前报道的LC3介导的选择性自噬的第二个主要核底物，这表明核自噬途径可能在细胞生理学中具有普遍的作用。未来的研究需要探索是否有更多的核自噬通路底物，并解答生物体如何调控核自噬通路底物的选择性或特异性的分子机理。 据悉，宾夕法尼亚大学Caiyue Xu博士和博士后Lu Wang为本文的共同第一作者。宾夕法尼亚大学Shelley Berger和哈佛大学Zhixun Dou为本文的共同通讯作者。哈佛大学Zhixun Dou课题组计划深入研究核自噬在细胞和机体衰老的作用和机制，目前正招收博士后研究员。 https://doi.org/10.1038/s41556-020-00579-5 1. Haigis, M.C. & Sinclair, D.A. Mammalian sirtuins: biological insights and disease relevance. Annu Rev Pathol 5, 253-295 (2010). 2. Dang, W. et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature 459, 802-807 (2009). 3. Dou, Z. et al. Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature 527, 105-109 (2015).
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