碱基编辑技术是基于CRISPR系统开发的基因组定向修饰技术。该技术由于不需要DNA双链断裂和外源供体DNA可以实现对目的碱基的精准替换，在疾病治疗、植物性状改良等方面具有很大的应用潜力。

不过，其脱靶效应仍是目前存在的一大难题。

高彩霞课题组长期致力于植物基因组编辑技术的创新及应用研究，前期已经在植物中建立了完善的胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editor, CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）技术体系，但是发现胞嘧啶碱基编辑器存在脱靶效应。为解决这一问题，团队展开进一步研究。

研究人员首先在水稻原生质体中建立并优化了基于R-loop的高通量碱基编辑器特异性评估方法。

该方法利用CBE作用于单链DNA的特性，通过SpCas9的正交蛋白nSaCas9在编辑靶点外的基因组区段诱导R-loop，从而人为制造单链DNA(single stand DNA, ssDNA)区域。

如果CBE的脱氨活性在这些区域产生脱靶编辑，可以通过高通量测序进行富集检测。

研究人员首先对已报道的5个胞嘧啶碱基编辑器分别通过R-loop方法和全基因组测序 （Whole-genome sequencing, WGS）进行特异性检测，发现R-loop方法与 WGS的结果一致，证明了R-loop方法的可靠性。且该方法与WGS相比，更加快速、便捷和经济。

在此基础上，研究人员通过对一系列理性设计的基于人源APOBEC脱氨酶的CBE的特异性进行筛选。

以编辑效率高且编辑窗口小的A3Bctd (a truncated APOBEC3B deaminase with enzymatic activity) 作为蛋白进化的原始底盘，根据蛋白结构信息预测与其脱氨的催化活性和ssDNA结合能力相关的结构域以及这些结构域中的重要氨基酸残基，通过理性设计获得16个单氨基酸替换的CBE变体。

并通过筛选获得了靶向效率维持较高且能较显著降低脱靶效应的7种单个氨基酸突变 （R211K, T214V,, R311K, Y313F, D314R, D314H 和 Y315M）。

为了进一步降低CBE的脱靶效应，研究人员将这些单氨基酸突变进行组合创制了9个多氨基酸替换变体，最终筛选得到了两种靶向编辑效率较高且特异性显著增加的CBE变体：A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3。

对编辑产物的分析显示，这两种变体在编辑窗口内主要产生单个C或者两个C的替换，显著提升了编辑的精确性。

最后，通过对150个水稻编辑植株的全基因组测序数据进一步证明了A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3的高特异性。

该工作结合基于结构信息的蛋白理性设计、植物个体全基因组脱靶检测技术和高通量R-loop脱靶检测技术，进一步提高了单碱基编辑的精确性，开发出的两种能保持高编辑效率且无随机脱靶效应的CBE变体，为基因治疗和植物分子设计育种提供了强有力的工具支撑。（韩扬眉）

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DOI:https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.07.005