Real time PCR引物设计原则

1、引物长度（primer length）为18-27bp（18-30bp）;

2、Tm（退火温度）为55~65℃（55℃～75℃），尽量保证上下游引物Tm值一致，二者差异最好不要超过5℃；

3、GC含量（composition）为40-60%，上下游引物的GC含量不能相差太大，四种碱基要均匀分布；

4、引物的产物大小一般80-150bp之间最为合适(可以延长至250bp)；

5、3′端：与模板严格配对，尽量为G或C，但不能为3个以上连续碱基；

6、5′端：可以引进修饰位点或标记物；

7、自由能ΔG：3′端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5′端和中间ΔG值相对较高的引物；

8、避免引物内含有互补序列（尤其是3′端）（因3′端对PCR的影响较大）；

9、避免3′端错配；避免引物二聚体，避免发夹结构存在；避免3′端使用碱基A;

10、建议设计跨内含子引物。