1.液体的配制:

（1）Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取Tris 3.03 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1 g，加双蒸水溶解，定容至1 L。

（2）转印缓冲液：称取Tris 2.272 g，甘氨酸10.8 g，量取甲醇适量（依据目的蛋白分子量而定），加双蒸水溶解，定容至750 mL。

（3）TBST：称取Tris 2.4 g，NaCl 8 g，量取Tween-20 1 mL，用双蒸水溶解，用浓HCl调节pH至7.6，定容至1 L。

（4）封闭液：称取脱脂奶粉5 g，溶于100 mL的TBST中。

2.蛋白电泳上样量:一般20~30μg；

               细胞样品一般：10~20μg；

               组织样品一般：20~40μg；

3. 胶浓度的选择：

分子量（kD）	胶浓度
140~200	6%
80~140	8%
25~80	10%
15~40	12%
<20	15%

               

4.电泳：

先把电压调至80V，待染料前沿至分离胶和浓缩胶交界处，Marker开始分离时，再将电压调整为120V，直至溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底端时立即停止电泳。

 

5.转膜：

①   膜的选择：

膜的孔径（可拦截蛋白的大小）

分子量>20 kD——0.45μm

分子量<20 kD——0.2μm

分子量<7 kD——0.1μm

②   转印时间的选择：

不同分子量蛋白在60V电压条件下的参考转印时间

目的蛋白分子量大小（kD）	参考转印时间（h）
80~140	1.5~2
25~80	1.5
15~40	0.75
20以下	0.5

 

③   转印液的选择：

目的蛋白>100 kD——甲醇浓度≤10%，可加入0.1%SDS；

目的蛋白<100 kD——甲醇浓度20%，不加SDS

6.内参的选择见Proteintech实验技术手册第15页

http://www.ptgcn.com/media/2942/2019laboratorymanual.pdf

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