通过氮响应的染色质调节提高绿色革命水稻品种产量

名称：Enhanced sustainable green revolution yield via nitrogen-responsive chromatin modulation in rice

期刊：Science

第一作者：吴昆 博士

通讯作者：傅向东 研究员

通讯地址：中科院遗传与发育研究所

DOI：http://dx.doi.org/10.1126/science.aaz2046

水稻sd1和小麦Rht-1等位基因促进生长抑制DELLA蛋白的积累，造成了植物的矮化，抗倒伏能力显著提高，大大促进了作物产量的提高。正常条件下，GA促进DELLAs的降解，促进植株生长。绿色革命水稻品种（GRVs）为了获得高产，需要高氮肥供应，而这与可持续发展的理念相违背。水稻产量主要由每株分蘖数、每穗粒数和千粒重决定，在高密植条件下提高分蘖能力有助于GRVs的高产，因此低氮条件下提高水稻分蘖数成为了未来农业可持续发展的一大目标。

结果

1、  氮肥通过NGR5促进水稻分蘖

研究人员发现南京6号（NJ6）的单株分蘖数、每穗粒数和单株产量随着N肥的供应而增加。南京6号的sd1近等基因系NJ6-sd1的分蘖数在不同氮肥水平下均高于NJ6，且呈现为氮依赖型分蘖数增多，小麦中也有类似现象。当外源GA处理或过表达GA受体GID1时，N促进的分蘖增加现象被抑制。进一步分析表明N诱导的分蘖增多不是由于测生芽数目的增多，而是由于出生芽数目增多和分蘖枝的伸长。

通过氮响应的分蘖数增加模式变化的EMS突变体筛选，鉴定到分蘖数对N供应不敏感且减少的突变体ngr5。图位克隆和互补实验表明NGR5（SMOS1,RLA1）编码一个AP2型转录因子。9311水稻的单株产量随着N供应增加而增加，而ngr5突变体中该现象却消失，且分蘖芽的形成不受N肥影响，而出初生分蘖芽的数目降低和分蘖枝生长较慢。这些表明氮响应的分蘖调控依赖于NGR5。

进一步研究发现，NGR5的转录和蛋白水平的丰度随着N肥的增加而增加，NGR5正调控水稻分蘖数。总的来说，氮促进NGR5的丰度，NGR5蛋白反过来又促进分蘖芽的生长；此外，NGR5是DELLA蛋白促进GRVs分蘖增多所必须的。

2、  NGR5抑制分蘖抑制基因的表达

RNA-seq分析表明ngr5突变体中全基因组的mRNA均发生了癌变，多种基因的表达量上升。基因富集分析表明表达上升基因和H3K27me3型组蛋白甲基化标记基因正相关，这些结果表明NGR5可能参与PRC2复合体介导的表观抑制。表达上升基因中由大量和分支抑制和分蘖数抑制相关基因，如D14，D3，OsTB1和OsSPL14等。qRT-PCR分析表明高氮供应减少这些基因的表达，但是ngr5突变体中该现象消失。D14和OsSPL14对NGR5具有上位性，表明D14和OsSPL14是NGR5的下游基因，且NGR5介导的氮促进分蘖增多是通过抑制D14和OsSPL14等分枝调控基因的表达实现的。ChIP-PCR和EMSA实验表明NGR5可以结合到 D14和OsSPL14上，且结合效应和N供应水平呈正相关关系。这些表明NGR5通过与分枝抑制基因结合，调控H3K27me3水平抑制其表达，从而促进N响应的分蘖增多。

3、  NCR5招募PRC2实现H3K27me3

为了探讨NGR5是如何调控氮促进的H3K27me3甲基化，利用Y2H、Co-IP及BiFC实验鉴定到LC2和NGR6互作，且lc2敲除突变体抑制由p35S::NGR5带来的分蘖增多，且D14和OsSPL14对LC2具有上位性。全基因组的H3K27me3甲基化组表明，氮介导的全基因组H3K27me3甲基化的重拍依赖于NGR5。

ChIP-seq鉴定到453个NGR5和LC2共同识别的结合位点，大多含有GCCGCC基序。野生型中D14和OsSPL14的转录随着N增加而减少，H3K27me3甲基化随着N增加而增加，但lc2突变体无这些现象，表明NGR6招募PRC2复合体（LC2为组成成分），H3K27me3甲基化修饰D14和OsSPL14等基因，抑制分蘖抑制基因的表达，促进芽生长和分蘖数增多。

4、  NGR5是GA受体GID1的靶基因

  氮诱导的分蘖数在GRVs显著提高，且该效应被外源GA处理抑制。利用RNA-seq和ChIP分析NGR5和GA处理的共同调控基因，结果表明GA处理和ngr5均可以抑制全基因组的H3K27me3修饰模式，但是PCA处理可以部分恢复H3K27me3修饰模式，表明N和GA介导的分蘖效应之间存在一定的联系。

      NJ6-gid1突变体在高低氮条件下的分蘖均多于NJ6，而OE-GID1分蘖数少于NJ6，且GA处理不影响 NJ6-gid1、NJ6-ngr5和NJ6-sd1-OE-GID1株系分蘖，GA诱导或GID1介导的分蘖抑制作用与ngr5的作用相似，这些结果表明GA-GID1介导的分蘖抑制作用依赖于NGR5的氮调控作用。

NGR5的丰度和GA水平呈现负相关关系，且GA对NGR5丰度的抑制作用可以被MG132处理缓解，表明GA促进NGR5的泛素化降解，而该降解过程在NJ6-gid1突变体中被抑制，表明GA促进NGR5的泛素化降解依赖于GID1的功能。

      GA响应一般是GID1激活DELLAs的降解，但是GA介导的NGR5降解在有无DELLA蛋白均可以发生，slr1-d6突变体中NGR5的降解任然能够被外源GA处理所降解,表明GA促进的NGR5降解不依赖于GA诱导的DELLAs降解，也不是其下游。分裂素酶互补和Co-IP实验表明GID1可以和NGR5直接互作，互作强度随GA浓度升高而增强。AP2-R2结构域就能完成GID1-NGR5之间的互作，NGR5也能和GID2互作。体外泛素化实验表明NGR5可以被GID2泛素化，表明NGR5是SCF^GID2复合体的基质。NGR5的降解过程被MG132、gid1-c1和gid2突变体抑制。综上所述，GA介导的NGR5的降解不是由于GA促进DELLAs的降解，而是由于直接互作，且GA促进NGR5-GID1互作，导致NGR5被SCF^GID2复合体多聚泛素化降解。

5、  DELLA-NGR5调节分蘖N响应

研究发现NGR5可以和DELLA蛋白SLR1直接互作，且LC-NGR5互作在SLR1存在是没有被抑制，表明SLR1-NGR5之间的互作不直接干扰LC-NGR5互作（NGR5功能发挥）。LHR1基序是NGR5和SLR1互作的基序，且包含LHR1基序的GRAS蛋白DLT和MOC1（分蘖控制相关）也和NGR5互作。

那么SLR-NGR5-GID1是否存在竞争关系呢？FRET分析表明GID1和NGR5的互作被RHt-B1b减弱，且NGR5降解速率下降。竞争实验表明NGR5的降解速率快于SLR1，表明NGR5和SLR1的竞争性于GID1互作，使NGR5-GID1互作减少。OE-NGR5株系中的NGR5-GFP含量可以被PCA处理诱导上升，而PCA和GA一起处理时NGR5表达被抑制。

那么DELLA促进水稻分蘖是否依赖于NGR5的功能？含SD1，GID1和NGR5等位基因的不同NILs表明DELLA介导的分蘖增多依赖于NGR5的功能。9311-sd1的NGR5丰度和分支抑制基因D14/SPL14的H3K277me3甲基化修饰程度高，D14/SPL14表达量低。表明sd1赋予的DELLA蛋白功能增强提高了N供应响应分蘖，并抑制了分枝抑制基因的表达，促进了分蘖增加。

6、  NGR5提高产量和NUE

在9311中提高NGR5的表达是否在减少肥料投入的情况下提高分蘖和产量？首先，作者在自然群体中分析了5种单倍型的表达，Hap2表达量相对较高，且含该单倍型品种的产量和产量高。研究发现，含Hap2单倍型或OE-NGR5的株系产量高，表明NGR5具有育种潜力。GRF4和NGR5的聚合可以进一步提高产量和NUE。

总结：

1、  氮肥引起的全基因H3K27me3甲基化修饰的改变依赖于NGR5的功能；

2、  GA-GID1促进NGR5的泛素化降解

3、  DELLA蛋白、NGR5蛋白和GA-GID1的竞争性互作，减少NGR5的降解，促进NGR5的功能

4、  NGR5 N依赖性的招募PRC2抑制分枝抑制基因的表达，促进N供应增加的分蘖。