蛋白磷酸酶95通过影响水稻磷酸盐的转运调控磷酸盐稳态

名称：PROTEIN PHOSPOHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affecting Phosphate Transporter                             Trafficking in Rice

期刊：Plant cell （8.631）

第一作者：Zhili Yang

通讯作者：毛传藻 教授（浙江大学）

DOI:10.1105/tpc.19.00685

前言

磷吸收主要由PHT1s家族的质膜（PM）定位的Pi转运蛋白（PTs）介导，水稻中有13个PHT1s。OsPT8转录水平不响应Pi饥饿，敲除该基因抑制Pi由源到库的再分配过程，OsPT1/4在Pi吸收和再分配同样发挥重要的作用。根中柱高表达的低磷诱导转运蛋白OsPT2在低磷条件下介导Pi吸收和根到地上部分的转运。

水稻OsPHO2不和PHT1家族的OsPT2/6/8互作,而与PHF1（ER定位）互作，调控转运蛋白PMs由内质网ER向质膜PM的转运。磷充足条件下，OsPT2 和OsPT8能够被酪蛋白激酶CK2磷酸化，抑制OsPT2/8和PHF1蛋白的互作，造成PTs滞留在ER，抑制PTs靶向到PM上，减少Pi吸收。但是PTs是如何去磷酸化的尚不清楚。

结果

1、  OsPP95 和PTs物理互作

蛋白磷酸酶是否参与PTs的去磷酸化过程，调控PTs的ER向PM的转运？利用蛋白磷酸酶抑制剂处理转OsPT2/8-GFP和OsCK2α3过表达植株(蛋白磷酸酶抑制剂)的水稻原生质体，发现GFP信号大多滞留在内质网，而未处理的原生质体GFP大多在PM上，但PPP型磷酸酶抑制剂没有该现象，表明蛋白磷酸酶是PTs去磷酸化和ER到PM转运所必须的，且该磷酸酶为PP2C型抑制剂。

作者利用以前研究的转录数据对90个PP2Cs在水稻根中表达进行研究，剔除59个低表达基因，并利用OsPT8为诱饵蛋白，分裂泛素酵母双杂系统对31个候选基因筛选，OsPP95为OsPT2/8互作蛋白，利用co-IP、GST-pull down和BiFC进一步验证表明OsPP95在体内外可以和PTs互作，互作区域为OsPP95N端的特异序列和PTs的C端。

2、  OsPP95在根和地上部分表达，且蛋白定位在所有亚细胞组分

  亚细胞定位表明OsPP95在所有亚细胞组分均有定位：核、胞质和ER。

  组织特异性表达模式分析表明OsPP95在根、茎节和叶中表达。

3、  OsPP95和CK2拮抗调控Pi稳态

磷充足条件下，OE- OsPP95株系的根和地上部分的生长迟缓，老叶叶尖坏死（Pi中毒症状），Pi积累量升高；磷缺乏田间下OE- OsPP95株系地上和根鲜重降低，磷积累增多。

磷充足/缺乏条件下，ospp95 敲除株系生长状态均和野生型相似。磷充足条件下，ospp95 敲除株系地上和地下部分的鲜重相似，幼叶Pi积累量降低，老叶Pi积累量升高；低磷条件下，ospp95 敲除株系干重无差异，根中磷积累量下降，地上部分Pi积累量无显著差异，但幼叶Pi积累量降低，老叶Pi积累量升高。表明，OsPP95参与调节水稻Pi稳态和分布。

  由于OsCK2和OsPP95 都能与PTs的C端互作，那么OsPP95和OsCK2起拮抗作用？利用杂交的方式获得α3-Ri / OsPP95-OV 和α3-OV / OsPP95-OV 株系, α3-Ri株系的Pi积累量高于WT，α3-Ri / OsPP95-OV的Pi积累量和α3-Ri株系相似，表明OsCK2和OsPP95在同一遗传途径中调控Pi稳态。磷充足条件下，α3-OV / OsPP95-OV 株系的地上和地下生长状态比单过表达株系好，Pi积累量为：α3-OV<WT<α3-OV / OsPP95-OV <OsPP95-OV。表明OsPP95-OV缓解α3-OV的影响。

    OsCK2也调控Pi分布？Pi充足条件下，KO- OsCK2α3株系在所有叶中的磷积累量上升，而OE-OsCK2β3转基因植株幼叶（第一二叶）磷积累量上升，而老叶（第三四叶）磷积累量降低。以上结果表明OsCK2和OsPP95拮抗调节磷在不同叶的分布。

4、  OsPP95直接去磷酸化PTs

体外磷酸化实验表明，OsPP95是一个Mn²⁺依赖型蛋白磷酸酶，具有磷酸酶活性。利用OsPT8特异性抗体检测OsPP95-OV和α3-OV水稻ER中的磷酸化OsPT8，α3-OV转基因植株OsPT8磷酸化程度高于野生型，显著低于OsPP95-OV株系，OsPP95-OV/α3-OV双过表达株系OsPT8磷酸化程度低于α3-OV转基因植株。且OsPP95在Ser-517位点去磷酸化OsPT8。

5、  OsPP95和CK2拮抗调节PTs的ER转移

通过检测α3-OV、OsPP95-OV和pp95突变体PT8在ER和PM分布水平发现，OsPP95-OV转基因株系在高磷状态下PT8主要在PM积累，而在ER上积累较少；pp95突变体在高低磷状态条件下在PM 积累较少，且在高磷状态下ER积累的更多。α3-OV转基因株系中PT8在ER积累少，PM上积累多，而双过表达植株的PM和ER定位处于两个但OE之间。此外，OsPP95-OV/α3-OV / OsPT8-GFP的根表皮细胞中GFP信号主要在PM上，α3-OV / OsPT8-GFP的GFP信号主要在ER上。表明，OsPP95和CK2拮抗调节PTs的ER转移。

6、  OsPP95蛋白在磷缺乏状态下比磷充足状态下更稳定

在磷缺乏状态和磷充足状态下，OsPP95的转录水平相似，那蛋白水平是否有差异？ ProPP95:gPP95-GFP / pp95-10转基因植株在磷缺乏状态下的荧光信号强，且无磷条件下OsPP95蛋白随着时间的延长而不断增加，添加Pi后又迅速降低。蛋白合成抑制剂CHX处理高磷状态下生长植株的PP95-GFP 8h，蛋白几乎全部降解，而无磷状态下生长植株的PP95-GFP却没有。MG132（26S蛋白酶体抑制剂）处理实验表明，OsPP95的降解依赖于26S蛋白酶体途径。

7、  OsPP95蛋白的降解部分依赖于OsPHO2

利用酵母双杂对Pi泛素化相关的蛋白进行筛选，并经BiFC验证发现OsPHO2和OsPP95互作。磷充足条件下，PP95-GFP / pho2 植株中OsPP95蛋白表达量多于PP95-GFP株系，而无磷条件下却相似。高磷条件下，CHX处理后PP95-GFP株系中PP96-GFP蛋白降解速度快，且PP95-GFP / pho2 植株泛素化的PP95-GFP少，表明OsPHO2通过泛素化途径参与OsPP95的降解。

  为研究pp95 和pho2的遗传互作，杂交获得pp95/pho2双突变体。磷充足时，双突变体的磷含量比pho2突变体低。pp95突变体在磷充足时的最嫩幼叶磷含量降低，而双突变体在前三嫩叶显著降低。磷酸化PT8蛋白在ER中的积累顺序: pho2突变体<pp95/pho2双突变体<WT<pp95突变体，而磷酸化PT8蛋白在PM的积累顺序：pho2突变体>pp95/pho2双突变体。表明OsPHO2通过OsPP95部分调控磷稳态和分配。

总结

1、  OsPP95是正调控磷稳态的PP2C型Mn²⁺依赖型蛋白磷酸酶，其非保守的N端和OsPT8互作。

2、  OsPP95和CK2拮抗性的调控PTs从ER向PM的转运，且磷酸化/去磷酸化的位点均为Ser-517；

3、  OsPP95调控磷转运和再分配，但幼叶和老叶的在转移的分子机理尚不清楚

4、  在磷充足时，CK2全酶（CK2α3和磷酸化的CK2β3）磷酸化PTs，抑制PHF1和PTs的互作，与此同时PHO2降 解PP95，抑制PTs的去磷酸化阻止PTs从ER向PM的转移。在磷缺乏时，CK2β3被降解，PHO2表达下调，PP95稳定性增强，去磷酸化PTs，促进PTs由ER向PM的转移，增加Pi吸收。