陆地植物液泡磷酸盐外流蛋白的鉴定

名称：Identification of vacuolar phosphate efflux transporters in land plants

期刊：Nature Plants（2019）

第一作者：LeiXu

通讯作者：易可可（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所）

DOI：https://doi.org/10.1038/s41477-018-0334-3

前言

液泡是植物体内储藏过多Pi的细胞器，能够根据代谢Pi需求和土壤Pi供应的变化调节胞质中Pi稳定。研究表明，具有SPX结构域和MFS结构域的液泡Pi转运蛋白（VPTs，也叫PHT5），在拟南芥中可以转运Pi进入液泡膜。但液泡Pi外排的转运蛋白鉴定尚不清楚。

大肠杆菌中甘油-3-磷酸（G3P）的吸收是由GlpT转运蛋白完成，GlpTs属于MFS蛋白家族成员，其在吸收甘油-3-磷酸进入细胞质时，会同时将1分子的Pi外排到细胞外周质。拟南芥中有5个GlpTs，其表达受低磷诱导，可能参与Pi稳态调控。到目前为止，尚未有GlpT蛋白参与植物的Pi动态平衡调节的报道。

结果

1、2个磷饥饿诱导的水稻VPEs蛋白定位在液泡膜

利用iTRAQ技术对有无Pi培养的水稻根总液泡膜蛋白进行分析，鉴定到前人报道的液泡膜Pi外排蛋白OsSPX-MFS3，低磷条件下蛋白水平降低。OsSPX-MFS3过表达和缺失植株的液泡中Pi含量会相应的升高/降低，表明OsSPX-MFS3其实是一个液泡Pi内流蛋白。

OsVPE1(Os04G46880)和OsVPE2（Os08G06010）受低Pi诱导，且定位液泡膜。跨膜拓扑预测，并利用PH敏感型GFP蛋白PEpHluorin和非PH敏感型GFP蛋白PRpHluorin标记发现，具有12个跨膜蛋白，C-、N-和关键环均位于胞质端，第一个环位于液泡腔。

表达分析表明，OsVPE1和OsVPE2受低Pi诱导，且OsPHR2是OsVPE1和OsVPE2响应Pi所必须的。Gus报告基因系统分析表明Pi充足条件下，根茎均有表达，但是在低Pi条件下，表达量显著升高。Pi充足时，OsVPE1主要在初生根成熟区的内外表皮和叶维管束中表达，低Pi时，叶肉细胞、初生根成熟区表皮、皮质和中柱也有表达。Pi充足时，OsVPE2在根冠、侧根原基和叶肉细胞表达；低Pi时，主要在叶肉和根细胞表达。

2、OsVPE1和OsVPE2介导酵母和爪蟾卵母细胞的Pi跨膜转运

利用AHD1启动子在Pi转运缺陷酵母菌株YP100表达OsVPE1 和OsVPE2发现，OsVPE1 和OsVPE2加快Pi的跨膜转运。在爪蟾卵母细胞中表达YFP–OsVPE2互补RNA并检测Pi转运发现，OsVPE2是在卵母细胞中质膜定位，在酸性PH下具有更高的活性，不具有G3P转运活性，为一个低亲和性Pi转运蛋白。

3、VPE1/ OsVPE2负调控液泡中Pi含量

OE- OsVPE1/ OsVPE2；（GFP-VPE1/2）株系的根液泡中的Pi下降，细胞质中Pi含量与野生型相似，总磷含量下降。正常条件下，OE株系的生长受到抑制，低磷处理后，生长抑制更加严重。

osvpe1和osvpe2插入突变体，RNAi株系及CRISPR/Cas敲除株系，液泡中Pi含量比野生型高，细胞质中Pi含量相似，总Pi含量上升，突变体生长缓慢。双突变体的Pi含量上升表型可以被恢复。表明OsVPE1和 OsVPE2是一个液泡Pi外排转运蛋白。

4、osvpe双突变体液泡Pi外排低于野生型，对Pi饥饿超敏感

双突变体液泡中的Pi含量高于单突变体，表明OsVPE1和 OsVPE2具有加性效应。

膜片钳实验表明双突变体和野生型相似。利用NMR技术检测低磷处理时突变体和野生型液泡膜Pi含量变化发现，双突变体根液泡中Pi含量减少量低于野生型。

低磷处理时，双突变体生长抑制更加严重，1-5d时PSIs基因表达显著提高，10-20d时表达相似。Pi饥饿报告系统表明，双突变体的GUS活性前期明显高于WT,后期活性相似。表明OsVPE1和 OsVPE2是液泡膜Pi外排转运蛋白，是水稻低磷胁迫下调控Pi稳态和生长所必须的。

5、被子植物VPE和早期分化的陆地植物GlpT蛋白均定位在液泡膜

VPE蛋白的双亮氨酸标记是液泡膜定位所必须的，且陆地植物GlpT蛋白的共同祖先军定位在液泡膜。

总结

1、  OsVPE1 和OsVPE2是水稻液泡Pi外排转运蛋白，负调控水稻液泡Pi含量

2、  OsVPE1 和OsVPE2在酵母细胞和爪蟾卵母细胞中可以转运Pi

3、  VPEs由古老的质膜定位的甘油-3-磷酸转运蛋白进化而来

4、  双亮氨酸特征是植物VPEs蛋白定位在液泡膜所必须的