水稻SPX6通过抑制转录因子PHR2负调控磷酸盐饥饿响应

名称：Rice SPX6 negatively regulates the phosphate starvation response through suppression of the transcription factor              PHR2

期刊：New Phytologist (2018)

第一作者：Yongjia Zhong

通讯作者：毛传藻 教授（浙江大学生科院）

DOI：10.1111/nph.15155

前言

水稻MYB转录因子OsPHR2是水稻磷吸收的关键转录激活子，也是低磷条件下细胞内的磷再分配的关键基因。PHR2可以直接结合到磷饥饿诱导基因（PSIs）的启动子或5‘非翻译区。水稻中有两条MicroRNA介导和   PHR2相关的途径： OsPHR2-miR399-PHO2和OsPHR2-miR827-OsSPX-MFS1&2 途径。

研究表明，水稻中的SPX蛋白家族可以负调控OsPHR2的活性和转录激活。水稻中6个SPX蛋白家族分为三个亚家族：SPX1/2; SPX4和SPX1/3/5。OsSPX1/2通过直接和PHR2互作，抑制PHR2蛋白活性及其与PSIs基因的结合能力。在低磷状态下，SPX4抑制PHR2的质核转移。在Pi充足时，SPX4被SDEL1/2泛素化降解， PHR2蛋白构象恢复，进入细胞核激活下游PSIs基因的表达，促进Pi吸收。SPX蛋白可以感知多磷酸肌醇（多磷酸肌醇）分子，SPX6尚未被系统研究。

结果

1、SPX1-6的Pi饥饿响应表达模式

除了SPX4，所有SPX基因在磷饥饿处理7天后表达均上调，SPX1/2在地上部分高度诱导，SPX3/5地上部分被轻微诱导，而SPX4不响应磷饥饿。在重新供应Pi 1天之后，所有SPX基因均回到正常水平。因此，SPX6是Pi信号途径的重要调控因子。

2、SPX6负调控PHR2的功能

在正常条件下，OX-SPX6转基因株系的生长受到抑制，生物量减少，地上部分的Pi积累下降，根中Pi积累量变化不显著，PSIs基因表达显著降低。RNAi-SPX6转基因株系中，地上部分的Pi积累量显著升高，根Pi积累量变化不明显；PSIs基因表达显著诱导上调。spx-talen转基因株系（缺AAAE四个碱基）的生长同样受到抑制，Pi积累上调，IPS1基因表达升高，且表型变化比RNAi-SPX6转基因株系更严重。

高磷状态下，OX-SPX4/PHR2双突变体中，由于OX-PHR2所引起的叶尖坏死和生长抑制表型得到缓解。地上部分的Pi积累量显著下降，PISs等基因表达回到野生型水平。

这些结果表明：SPX6负调控水稻Pi信号转导和Pi稳态。

3、SPX6和PHR2互作

利用C-PHR2作诱饵（全长PHR2具有对酵母具有毒性，且N-PHR2具有转录激活活性）进行酵母双杂，和Co-IP表明SPX6和PHR2在体内外均可以发生互作。

4、SPX6干扰PHR2的质核转移

亚细胞定位实验表明SPX6定位在细胞核和细胞质。BiFC实验表明，SPX6和PHR2在细胞核和细胞质中均能发生互作，SPX6可以形成同源二聚体，和SPX4可以形成异源二聚体。在番茄叶片中瞬时共表达35S-SPX6-GFP和35SPHR2-mCherry发现,SPX6可以改变PHR2的亚细胞定位。

5、SPX6抑制PHR2和靶基因的结合

利用EMSA和双荧光素酶报告系统，检测SPX6对PHR2-P1BS基序结合的影响。结果表明，SPX6抑制PHR2和P1BS基序的结合能力。

6、Pi饥饿处理时，SPX6蛋白表达水平和表达模式分析

利用SPX6pro-gSPX6-GFP转基因幼苗检测Pi饥饿处理的不同时期的转录和翻译水平。结果表明，SPX6的表达水平随着Pi饥饿处理时间的增长而增加，在添加Pi后SPX6表达下降。地上部分的SPX6蛋白积累在第3小时开始减少，随着时间的推移减少量不断增加，直至不能检测到，添加Pi后，SPX6蛋白迅速回到正常水平。根中SPX6蛋白的积累量在Pi缺乏时不断增多，当添加Pi后，迅速减少到正常水平。细胞外降解实验分析表明，SPX6通过26S蛋白酶体泛素化降解。

GUS报告基因系统研究表明，在Pi充足时，SPX6在叶中高表达，而SPX4在叶和根中均高表达。当Pi缺乏时，叶中SPX4和SPX6表达量均下降，而根中SPX6在根分生组织积累，而SPX4却降解。

7、PHR2介导SPX6诱导的Pi饥饿响应

利用EMSA检测低磷条件下PHR2是否直接调节SPX6的P1BS基序，结果表明PHR2可以直接结合到SPX6的3个P1BS基序。且phr2突变体株系在低磷条件下地上和地下部分的SPX6的表达降低。表明PHR2通过结合到SPX6启动子上的P1BS基序，介导SPX6诱导的Pi饥饿响应。

8、SPX4和在负调控Pi信号和Pi稳态的功能上具有加性效应

低磷条件下，spx4-talen/ spx6-talen双突变体比单突变体的生长抑制更加明显。高磷条件下，地上部分和地下部分的Pi积累量显著高于单突变体，IPS1表达量更高。表明SPX4和在负调控Pi信号和Pi稳态的功能上具有加性效应

讨论：

1、  SPX6通过和PHR2直接互作抑制PHR2功能，而负调控Pi信号途径；

2、  SPX6可能主要在地上部分发挥功能；低磷条件下SPX6在根中积累，可能参与根的分化；

3、  过表达和抑制SPX6均造成生物量降低，暗示提高P利用率操时，胞内Pi稳态调控的精细控制需要多个基因的共同作用；

4、  SPX结构域中的AAAE四个氨基酸时SPX6和PHR2结合所必须，删除不影响多磷酸肌醇的结合能力，影响蛋白的正确折叠改变蛋白的结构；

5、  SPX6的功能和SPX3/5更加相近；但SPX6可能是唯一通过不同的机制调节PHR2的SPX蛋白；

6、  当Pi充足时，SPX4和SPX6在细胞质与PHR2结合，抑制PHR2的质核转移，在细胞核中，SPX6也能与PHR2结合，抑制PHR2对下游PSI基因的激活能力，保持PSIs低表达；低Pi条件下，SPX4和SPX6被泛素化降解，PHR释放并进行质核转移，在核中，与PSIs基因启动子上的P1BS基序结合，激活PSIs的表达，促进Pi的吸收。

问题：

1、  SPX6形成二聚体的生物学意义；

2、  SPX6的E3泛素化连接酶的鉴定；

3、  低磷条件下，SPX6在根中积累的生物学意义。