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长春中医药大学孙丽平教授团队4D蛋白组解析中药复方抗炎机理

已有 996 次阅读 2022-5-9 16:08 |系统分类:论文交流

细菌性肺炎是一种常见的急性下呼吸道感染疾病[1]。肺炎链球菌 (S.pn) 是主要致病菌[2]，其产生的毒力因子肺炎链球菌溶血素 (PLY) 可以诱导宿主毛孔依赖性促炎反应，这在肺炎球菌的致病性中起主要作用[3]。抗生素虽然可以有效治疗细菌性肺炎，但其耐药及滥用等问题在全世界范围内蔓延使得抗生素已不再是感染性疾病的最佳治疗手段，因此急需寻找新的治疗策略。


传统中医药对感染性疾病的治疗已有数千年的历史，临床疗效显著。越来越多的学者着眼于中医药在细菌感染方面的治疗。长春中医药大学附属医院王烈教授认为“热毒”是小儿肺炎的主要致病原因，提出了“无毒不发热，热因毒而起”的“热毒理论”[4]，创立了治疗小儿肺炎的经验方-清肺饮 (QFY)，其组方轻巧，药少而精，治以清热解毒、化痰止咳。然而，QFY治疗细菌性肺炎的抗炎机制尚不明确，值得深入研究与探讨。

近日，长春中医药大学孙丽平教授团队在Frontiers in Pharmacology 上发表了题为“Activation of Autophagy Through the NLRP3/mTOR Pathway: A Potential Mechanism for Alleviation of Pneumonia by QingFei Yin” 的研究论文[5]。研究运用全新一代4D蛋白质组学技术，揭示了QFY治疗肺炎的抗炎机制，为未来减少抗生素应用发挥中医药优势提供了新的治疗策略和实验依据。景杰生物为该研究提供了4D蛋白质组学技术支持。

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01 QFY治疗S.pn肺炎小鼠的疗效评价

研究者首先从小鼠左鼻滴入S.pn菌液以建立体内肺炎模型，并进行中药复方QFY治疗。应用Micro-CT、H&E染色和ELISA法评价QFY对S.pn肺炎小鼠的保护作用。Micro-CT扫描图像和H&E染色结果显示：QFY治疗后小鼠肺部斑片状、不均匀阴影的密度低于未经治疗的S.pn感染小鼠，小鼠肺组织肿胀、充血、炎症细胞浸润均出现不同程度的减轻。此外，QFY可减少S.pn感染引起的IL-1β和TNF-α炎症因子释放，逆转肺部炎症反应 (图1)。以上结果表明，QFY可治疗S.pn感染引起的小鼠炎症性肺损伤，对肺炎小鼠起到保护作用。

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图1 QFY治疗S.pn诱导的小鼠肺炎损伤

02 蛋白质组学分析QFY对S.pn感染小鼠的蛋白调控

为了揭示QFY减轻S.pn诱导的小鼠肺炎的确切分子机制，研究应用4D蛋白质组学技术分析小鼠肺组织各组之间的差异表达蛋白。结果显示S.pn感染后，鉴定出上调蛋白433个，下调蛋白222个，QFY治疗后有345个差异蛋白，其在细菌侵袭、炎症反应、免疫调节、防御机制等生物学过程均有显著富集 (图2)。为了进一步探讨S.pn感染期间QFY的作用机制和靶点，对差异表达蛋白进行了KEGG信号通路富集分析。值得注意的是，如图2所示，发现有超过40多个差异蛋白功能依赖性地参与NOD样受体和自噬信号途径，推测NLRP3和自噬通路与S.pn诱导的肺炎的致病过程有关，可能作为清肺饮的潜在作用靶点。

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图2 蛋白质组学揭示QFY对NOD样受体和自噬信号通路的调控作用

03 体内外实验验证QFY对NLRP3/自噬信号通路的调控作用

接下来，研究人员应用Western Blot和免疫组化 (IHC) 等方法，进一步验证了体内外水平QFY对NLRP3/自噬信号通路的调控作用。体内水平显示当S.pn感染时，NLRP3被激活使其蛋白表达量升高，同时引起ASC、cleaved-caspase1和磷酸化的NF-κB p65蛋白水平升高。同时，S.pn导致mTOR依赖性自噬受抑制，这可以通过S.pn感染48h的小鼠肺组织中的mTOR磷酸化和p62堆积来验证的。然而，QFY治疗后均显著地将这些蛋白恢复到正常水平。体外水平显示，应用S.pn的毒力蛋白PLY诱导小鼠肺泡巨噬细胞 (MH-S) 建立体外炎症模型。QFY干预后在蛋白水平与体内实验结果相一致 (图3)。上述结果证实了QFY可以通过下调NLRP3炎症小体和修复受损自噬，从而减轻S.pn 诱导的小鼠肺炎。然而，NLRP3和自噬的双向调节机制，以及明确QFY的具体作用靶点尚不明确，仍需进一步深入研究。

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图3 QFY对S.pn小鼠NLRP3/自噬信号通路的调控作用

04 激活自噬明确QFY治疗细菌性肺炎的作用机制

为了进一步探索QFY调控NLRP3和自噬的确切靶点，研究者应用特异性自噬抑制剂3-MA和NLRP3 siRNA转染技术进行更深入的机制研究。结果证实，即使在3-MA存在的情况下，QFY仍然逆转了PLY诱导的NLRP3表达的增加，而siRNA把NLRP3沉默后，通过触发mTOR依赖性自噬得到与QFY相似的治疗作用 (图4)。

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图4 QFY通过下调上游NLRP3/mTOR信号通路启动自噬

综上所述，QFY在S.pn诱导的体内小鼠肺炎模型和体外PLY刺激的MH-S细胞炎症模型中均具有显著的抗炎作用。4D定量蛋白质组学分析表明，QFY在NOD样受体和自噬信号通路均显著富集，且NLRP3和自噬存在相互调节关系。最终结果表明QFY通过抑制NLRP3/mTOR信号通路启动自噬，减少炎症反应发生，从而减轻肺部损伤。

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图5 QFY治疗细菌性肺炎的机制概述

参考文献

1. RUDAN I, et al. Epidemiology and etiology of childhood pneumonia. Bull World Health Organ.
2. GBD, et al.2018. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016 . Lancet Infectious Diseases.
3. Swanson. K. V.,et al. 2019. The NLRP3 Inflammasome: Molecular Activation and Regulation to Therapeutics. Nat. Rev. Immunol. 
4. 孙佳红, 王烈, 孙丽平. 王烈运用清感方治疗小儿风热感冒[J]. 长春中医药大学学报.
5. Sun Xiaozhou,et al. 2022. Activation of Autophagy Through the NLRP3/mTOR Pathway: A Potential Mechanism for Alleviation of Pneumonia by QingFei Yin. Front Pharmacol. 
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