阿尔茨海默病（AD）是痴呆症最常见的病因之一，美国有500多万AD患者，全球约有4700万。基于淀粉样蛋白级联和tau假说，脑脊液（CSF）和血液/血浆/血清中不同的Aβ以及tau种类蛋白生物标志物已被检测与脑病理相关。为鉴定新颖的AD候选生物标志物，越来越多的研究者开始对人类样品进行无偏蛋白质组分析，但是后续的大规模验证以及对可靠候选标志物的定义仍然极具挑战性。

近期，美国圣裘德儿童研究医院的研究人员在Molecular Neurodegeneration（IF=9.599）上发表了关于多维度蛋白质组综合分析揭示AD线粒体特征的文章，通过整合AD的多种蛋白质组（包括皮质、CSF和血清）鉴定到具有高可信度的候选标志物。研究首先通过TMT蛋白质组学定量技术进行超深度覆盖分析，再使用系统生物学方法对其中最有前途的AD特征蛋白进行优先级排序，最后通过ELISA和TOMAHAQ靶标MS分析，验证了MS发现鉴定到的候选生物标志物。

1. 10个蛋白质组学数据集的全面整合分析

为了系统研究与AD发病机制相关的生物流体标志物，研究人员运用TMT蛋白质组学定量技术（质谱策略）对10个独立的AD蛋白质组学数据集进行了全面的综合分析，总共包括来自365例AD、MCI（轻度认知障碍）以及健康人群的17541个蛋白（13216个基因）。通过比较蛋白质组数据集的检测深度，证实本研究具有较高的AD组织/生物流体蛋白质组的数据质量及覆盖深度。

图1. 数据集整合分析

2. 超深度CSF蛋白质组分析，AD中线粒体蛋白显著下调

为了在超深度蛋白质组中探索新型AD候选生物标志物，研究人员应用新开发的深度生物流体分析流程，从CSF中共定量到5941个特异性蛋白，355个差异蛋白，其中最显著下调的68个蛋白中有67个为线粒体蛋白。已知这些蛋白质在支持能量代谢、线粒体生物合成、活性氧还原和线粒体DNA修复方面具有功能作用。

值得一提的是，这部分 蛋白质由于丰度较低， 在过往的CSF研究中几乎没有报道，这表明超深度分析为AD的蛋白质组学分析提供了新的发现。总而言之， 本研究的CSF蛋白质组学分析涵盖了大多数先前报道的AD中CSF生物标志物，并揭示了AD患者中线粒体蛋白表达水平显著降低。

接着，研究人员比较了不同的 CSF 蛋白质组学结果，表明 SMOC1、 GPNMB （ 在先前的研究中已被报道过） 以及 C1QTNF5、OLFML3、SPON1、SLIT2 （新颖） 可作为CSF的潜在生物标志物，且具有可重复性。 以上 6 种与 AD 发病机制密切相关的蛋白表达水平在轻度认知障碍患者的皮质中开始升高，这暗示了它们作为 AD 早期诊断生物标志物的潜力。

图2. 蛋白质组分析AD中线粒体特性

3. CSF vs 血清 vs 皮质蛋白质组的整合分析

紧接着，研究人员系统地比较了 CSF、 血清和皮质的蛋白质组学结果。分析发现， 37 个蛋白在血清、 CSF 和皮质蛋白质组中均有差异表达，其中有 22 个是线粒体蛋白质。另外，研究人员发现，在人和小鼠 CSF中 下调的 6 个线粒体蛋白中，有 4 个在 AD 血清中同样下调（ALDH6A1、ETFB、SOD2和PRDX3） ，这表明 它们作为 AD 生物流体特征的稳定性 。

接下来，研究人员分析了在 CSF 和血清中的差异表达蛋白，其中 52 个是线粒体蛋白，它们在 AD 血清和 CSF 中均降低；血清和皮质中的 94 个差异蛋白中大多数在皮质中表达增加而在血清中表达减少，包括 21 个线粒体蛋白。综合分析表明， 线粒体蛋白的改变是作为从大脑皮层传递到脑脊液和血清最一致的 AD 信号。

最后，候选生物标志物经ELISA和TOMAHAQ检测进一步得到验证，证实了AD样品中候选生物标 志物GPNMB 表达增加 。同时，基于TOMAHAQ的靶向MS分析法验证CSF样品中两种线粒体蛋白AK2 和 PCK2 的 表达减少。

3. 候选生物标志物验证

研究人员通过新建立的TMT蛋白质组学定量技术分别从人脑皮层、CSF和血清中定量了13,833、5941和4826个蛋白，表明AD皮层、CSF和血清中许多线粒体蛋白发生了明显变化。通过对来自三个独立的深度蛋白质组学研究的10个AD组织和生物液蛋白组学数据集的一系列综合分析，发现了许多具有高可信度的AD候选生物标志物，为AD群体大规模生物标志物验证提供了丰富的经验。

参考文献：

1. Wang H, et al. 2020. Integratedanalysis of ultra-deep proteomes in cortex, cerebrospinal fluid and serumreveals a mitochondrial signature in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener.

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