糖尿病肾病（DN）是导致终晚期肾病的最主要因素，目前其治疗主要依赖于对高血糖和高血压的控制。但是临床发现，糖尿病肾病在许多患者身上仍然继续进展，这表明需要额外的方法来阻止其发展。过往研究发现，TGF-b1/Smad3信号通路在糖肾的疾病发展过程中发挥了重要作用，而Smad3缺乏可防止1型糖尿病肾病小鼠的蛋白尿和肾纤维化，并对高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病具有抵抗力。相比之下，Smad4在糖尿病或糖尿病肾病中的作用知之甚少。

近日，广东省人民医院院长和华南理工大学医学院院长余学清教授，与广东医科大学李锦华教授为共同通讯作者，在著名学术期刊EMBO Reports上发表了最新研究文章，证实Smad4在肾脏中的缺失可以有效阻止2型糖肾小鼠的足细胞损伤和肾小球硬化。足细胞中条件性Smad4缺失可以保护小鼠免于2型糖肾，并且此过程与肥胖无关。高血糖会诱导Smad4定位于足细胞中的线粒体，导致糖酵解和氧化磷酸化减少，并增加活性氧含量。这种结果一定程度上依赖于Smad4与PKM2直接互作，以及对具有活性的四聚体形式PKM2的减少。此外，Smad4与ATPIF1相互作用导致了ATPIF1降解减少。景杰生物为该研究的蛋白质组学定量提供了技术支持。

为了明确Smad4在正常和糖肾足细胞中的表达量是否有差异，研究者分别检测了人和小鼠足细胞在病理和生理情况下Smad4的表达。发现Smad4在糖肾足细胞中高表达（Figure 1a），并且Smad4缺乏可显著降低糖肾患者蛋白尿并改善肾功能。研究者进一步利用Smad4缺乏且eNOS-/- 小鼠诱导2型糖肾，发现Smad4缺乏且eNOS-/-糖尿病小鼠的系膜基质扩张和肾小球硬化有明显缓解（Figure 1c）。同时，研究者发现生理情况下，肾脏足细胞Smad4与Tom20（线粒体标记物）的共定位很少，而糖尿病肾小球中Smad4与Tom20明显增多，提示Smad4可能在线粒体中发挥作用。

图1 肾足细胞中Smad4检测及肾小球PAS染色

为了探讨Smad4缺乏对肾脏的保护作用是否与糖酵解有关，作者分别在WT和Smad4缺乏足细胞中对一系列代谢指标进行检测。在正常和高糖条件下，足细胞中Smad4缺失增强了基础呼吸、最大呼吸和ATP相关呼吸，但没有增加质子泄漏，说明氧化磷酸化活力得到了提高（Figure 2a）。电镜结果显示，这一过程并没有改变线粒体的形态和拷贝数，参与糖酵解的三种限速酶也没有发生蛋白水平的改变。与野生型足细胞相比，Smad4缺乏的足细胞在正常和高糖条件下产生乳酸的能力更强，活性氧(ROS)的产生减少（Figure 2b）。提示Smad4的缺乏可以促进糖酵解，调节氧化磷酸化活性，降低ROS的生成，并防止高糖诱导的足细胞损伤。

图2肾足细胞氧耗量，耗氧率，乳酸，活性氧检测

为了进一步研究Smad4调控线粒体氧化磷酸化活性的分子机制，研究者选取正常或高糖处理的Smad4缺乏和WT小鼠足细胞（样本策略）进行了TMT标记定量蛋白质组学研究（质谱策略），共鉴定到5228个蛋白质。生信分析显示，与正常和高糖条件下的野生型足细胞相比，Smad4缺乏导致ATP合酶抑制剂、氧化磷酸化活性调节因子1 (ATPIF1)的蛋白水平降低（Figure 3a）。同时，线粒体丙酮酸载体1 (MPC1)表达下调，而MPC1影响丙酮酸进入线粒体中的氧化磷酸化，以及参与线粒体呼吸链的蛋白，如Ndufs4、Ndufb10、Uqcrb、Cox7a21和Cox5a（Figure 3b）。由于ATPIF1抑制和丙酮酸进入线粒体的限制引起的ATP合酶活性增加导致MPC1的下调，所以，Smad4缺乏可能通过增加线粒体氧化磷酸化，降低线粒体活性氧的生产效率，从而发挥高葡萄糖诱导损伤的保护作用。

图3 正常或高糖处理的Smad4缺乏和WT小鼠足细胞定量蛋白质组学

除此之外，研究者还证明Smad4对糖酵解过程的调节作用，一定程度上依赖于其与PKM2的直接互作导致了具有活性的四聚体形式PKM2的减少。而Smad4与ATPIF1相互作用则导致了ATPIF1降解减少。

综上所述，本文 利用基于质谱的高通量蛋白质组学技术结合其他方法对Smad4在糖尿病肾病当中的作用进行了综合研究。证实 Smad4在肾脏中的缺失可以有效阻止2型糖肾小鼠的足细胞损伤和肾小球硬化。 足细胞中的Smad4可以通过与PKM2及ATPIF1等蛋白互作，来完成对糖酵解和氧化磷酸化过程的调节，发挥其在糖尿病肾病中的重要诱导作用。此项研究也为后续糖尿病肾病的治疗提供了新的思路和实验依据。

参考文献

1. Jinhua Li, et al., 2020, Smad4 promotes diabetic nephropathy by modulating glycolysis and OXPHOS. EMBO Reports.

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