景杰编者按：泛素-蛋白酶体系统（UPS）通过底物识别，泛素结合，蛋白酶体降解等一系列步骤调控细胞内蛋白质的降解。在哺乳动物中，E3泛素连接酶和去泛素化酶（DUBs）分别通过催化蛋白质的泛素化和去泛素化修饰调控蛋白质的降解和转换，将泛素的内稳定维持在一个高度动态的过程。泛素特异性蛋白酶USP14是唯一能够与蛋白酶体19S调控颗粒可逆结合的USP家族，并通过去除底物上的泛素链抑制其被降解。目前研究已发现USP14参与了细胞的不同生理过程和多种疾病的发生，对其底物的系统鉴定有助于我们全面了解USP14的功能特征以及细胞内复杂的蛋白酶体相关的去泛素化事件。

中国科学院上海药物研究所研究员谭敏佳课题组与复旦大学中山医院内分泌科教授李小英团队合作，通过基于质谱技术的蛋白质组，泛素化修饰组以及蛋白质互作组学分析，系统的筛选了USP14的底物，并揭示了与USP14高度相关的多种新的细胞通路，尤其是脂肪代谢和碳水化合物代谢。与生物信息学分析结果一致，研究者进一步证实了脂肪酸合成酶（FASN）是USP14的特异性底物，USP14通过介导FASN去泛素化，增强其稳定性，从而促进甘油三酯的聚集。该成果揭示了肝脏脂肪变性的病理过程中一个崭新的分子机制，发表在Nature communications （IF: 12.353）上。

研究者前期利用Affymetrix arrays发现高脂饮食小鼠肝脏中包括USP14在内的数个USP家族成员相较于正常饮食小鼠表达上调。USP14转录上调的现象在瘦素受体缺陷小鼠（db/db）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）病人的肝脏组织中也得到验证。此外，USP14mRNA的上调还与肝组织中甘油三酯（TG）含量相关（图1）。以上结果证实USP14上调是肝脏脂肪变性的一个保守的特征，可能在非酒精性脂肪性肝病进展中发挥重要作用。

图1 USP14在肥胖小鼠及NAFLD肝脏中上调 

为了系统鉴定USP14相关的底物，研究者们利用SILAC标记的定量蛋白质组及泛素化修饰组学技术，选取USP14内源性高表达的Hela细胞，并构建USP14敲除的稳定细胞系模型，以大于1.2倍变化为标准，定量蛋白质组学鉴定到108个下调蛋白和50个上调蛋白，泛素化修饰组学鉴定到392个位点发生显著的泛素化修饰上调（图2）。

图2 定量蛋白质组学及泛素化修饰组学技术鉴定USP14相关底物

对USP14敲除后表达及泛素化修饰发生变化的蛋白进行生物信息学分析发现，除了已有研究报道过的蛋白酶解，凋亡，NF-κB通路等， 还发现USP14在细胞功能（脂肪酸代谢，碳水化合物代谢），信号调控（EGFR, PPAR, PI3K-Akt等）及细胞表观遗传机制（染色质功能，染色质-DNA结合等）中发挥重要作用（图3）。

 图3 USP14敲除后脂肪酸与三羧酸循环通路的改变

研究者为了进一步找到USP14的直接作用底物，将免疫共沉淀得到的USP14互作蛋白质组与USP14敲除后表达下调的蛋白和泛素化修饰上调的蛋白进行两两比较，得到了42个潜在的USP14底物（同时存在于两个数据集合中），其中脂肪酸合成酶（FASN）存在于全部三个数据集中（图4）。Western blot进一步在USP14敲除细胞中确认其表达下调，提示FASN很可能是USP14的直接底物。

 图4 USP14作用底物的鉴定

随后研究者在小鼠原代肝脏细胞（MPH）中验证了FASN与USP14的内源性结合，USP14在转录后水平调控FASN的表达，通过调控其泛素化水平影响FASN的半衰期（图5）。

图5 验证FASN是USP14的直接作用底物 

USP14对FASN稳定性的调节作用促使研究者们进一步寻找USP14在肝脏TG代谢中的作用。对C57BL/6小鼠进行尾静脉注射含野生型，激酶失活型以及GFP对照的腺病毒可以观察到，注射WT-USP14病毒的小鼠肝脏中USP14表达升高，FASN蛋白水平同样增高，而mRNA表达量不变。同时，小鼠的肝脏重量和TG含量明显增高，血液TG水平也增高，并出现糖耐量异常和胰岛素敏感性下降。利用RNA干扰腺病毒下调FASN表达可以很大程度上阻断USP14过表达引起的上述效应（图6），提示FASN部分介导了USP14对肝脏TG代谢的调控作用。

图6  USP14过表达促进肝脏脂肪变性

研究者进一步调查了USP14在肥胖相关的肝脏脂肪变性中的作用。用USP14特异性的小分子抑制剂IU1和shUSP14腺病毒分别处理db/db小鼠，均可导致肝脏组织中TG含量和FASN蛋白水平的下降，小鼠的肝脏脂肪变性程度明显减轻。不仅如此，USP14的下调还显著改善了db/db小鼠的高血糖，高胰岛素血症和胰岛素抵抗的情况（图7）。

图7 下调USP14改善db/db小鼠肝脏脂肪变性 

本文通过全蛋白组，泛素化修饰组及蛋白质互作组学联合分析的方法系统的寻找USP14在体内的直接作用底物，首次揭示了USP14在肝脏脂肪变性中不可或缺的作用，并为脂肪肝及相关的代谢疾病提供了治疗靶点。

景杰生物官网：www.ptm-biolab.com

业务咨询电话：400-160-1145

参考文献：

Liu B, et al. (2018), Proteome-wide analysis of USP14 substrates revealed its role in hepatosteatosis via stabilization of FASN. Nat Commun.