背景：

糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最常见和最具挑战性的慢性并发症之一，发生在较长的疾病和难治性治疗周期中。关于DFUs的一个令人兴奋的研究领域集中在巨噬细胞的异常极化上，巨噬细胞在介导糖尿病伤口的慢性炎症中起着关键作用。具体而言，从促炎表型到促愈合表型的受损转变导致炎症介质聚集并阻碍糖尿病伤口愈合。因此，探索糖尿病创面慢性炎症的致病因素，开发更好的个体化防治方法具有重要的科学意义。（图1）

中度炎症对于标准伤口愈合至关重要。在糖尿病等病理条件下，长期和难治性伤口与过度炎症有关，表现为持续的促炎巨噬细胞状态。然而，机制仍不清楚。本研究科学家进行代谢组学分析，并在糖尿病足溃疡中发现显着的苯丙酮酸积累。增加苯丙酮酸会损害伤口愈合并增加炎症反应，而通过饮食苯丙氨酸限制减少苯丙酮酸可缓解不受控制的炎症并有益于糖尿病伤口。在机制上，苯丙酮酸以清除受体CD36依赖性方式摄入巨噬细胞，与PPT1结合，并抑制去棕榈酰化酶活性，从而增加NLRP3蛋白的棕榈酰化。发现增加NLRP3棕榈酰化可增强NLRP3蛋白稳定性，减少溶酶体降解，并促进NLRP3炎症小体活化和炎症因子（如白细胞介素（IL）-1β）的释放，最终触发促炎巨噬细胞表型。科学家研究提出了一种靶向苯丙酮酸的潜在策略，以防止糖尿病伤口过度炎症。

主要研究内容

l 苯丙酮酸介导糖尿病伤口中的炎性巨噬细胞浸润

l 饮食苯丙氨酸限制是减少苯丙酮酸积累的策略

l 苯丙酮酸通过CD36进入巨噬细胞，促进M1巨噬细胞极化

l 苯丙酮酸与PPT1蛋白结合并增加NLRP3棕榈酰化水平

苯丙酮酸通过与PPT3蛋白结合来调节NLRP1棕榈酰化

PPT1作为硫酯酶，可以从S-酰化蛋白中去除棕榈酸，这对于动态棕榈酰化至关重要。由于苯丙酮酸被证明抑制PPT1活性，我们想知道苯丙酮酸是否可以调节NLRP3棕榈酰化。为了探究棕榈酰化对NLRP3的作用，我们首先通过在线软件CSS-Palm（http://csspalm.biocuckoo.org/）预测了NLRP3上的棕榈酰化位点。结果表明，NLRP3上的几个棕榈酰化位点在不同物种中高度保守。在BMDM中使用酰基生物素交换（ABE）测定，我们验证了NLRP3被棕榈酰化。由于S-棕榈酰化可以控制蛋白质的稳定性和运输，我们随后通过用一般的S-棕榈酰化抑制剂3-溴棕榈酸酯（2）处理细胞来探索棕榈酰化是否影响NLRP2蛋白水平。NLRP3的蛋白质水平以剂量依赖性和时间依赖性方式降低2BP。

为了进一步验证我们的假设，我们随后关注PPT1是否可以调节NLRP3的棕榈酰化。PPT1最初被描述为定位在溶酶体腔中，但最近的研究表明其生物学功能与溶酶体外定位有关。我们的免疫荧光染色显示，PPT1和NLRP3在溶酶体腔和溶酶体外位点均存在共定位。此外，免疫沉淀测定表明PPT1和NLRP3之间存在相互作用。我们还进行了ABE测定，发现PPT1缺乏增加了NLRP3的棕榈酰化。基于棕榈酰化位点预测分析，确定NLRP6的半胱氨酸残基405、783、784、834、835、840、841和3为潜在的棕榈酰化位点，在其他物种中是保守的。与半胱氨酸残基6的最大预测得分一致，我们发现NLRP6中C3A的突变大多消除了其棕榈酰化，PPT1缺乏不能再增加其棕榈酰化，表明C6是NLRP3中的主要棕榈酰化位点。随后，我们发现苯丙酮酸处理可以增加NLRP3的棕榈酰化。此外，Ppt1 MUT质粒转染逆转了苯丙酮酸诱导的NLRP3蛋白棕榈酰化增加，而Ppt1 WT转染则没有。我们还发现，在阻断棕榈酰化的2BP存在下，用苯丙酮酸处理不能增加NLRP3的表达水平。总体而言，苯丙酮酸可以通过结合和抑制PPT3活性来增加NLRP1的棕榈酰化。

PPT1是一种硫酯酶，可从S-酰化蛋白中去除棕榈酸，PPT1表现出广泛的底物特异性。PPT115棕榈酰辅酶A水解酶活性有三个基本位点，即S233，D289和H1。研究的分子动力学模拟表明，苯丙酮酸与PPT1残基Lys229和Gly245有利结合。S-棕榈酰化是蛋白质的可逆共翻译和翻译后修饰，其中棕榈酸酯主要通过硫酯键与半胱氨酸残基共价结合。棕榈酰化修饰由棕榈酰转移酶和去棕榈酰化酶的稳态决定。它在人类生理和病理过程中起着至关重要的作用，包括蛋白质膜锚定、运输、降解和相互作用。我们发现NLRP3在巨噬细胞中被棕榈酰化，NLRP3中主要的棕榈酰化位点是半胱氨酸残基6。苯丙酮酸处理增加了NLRP3棕榈酰化，PPT1的结合位点突变体逆转了苯丙酮酸处理诱导的棕榈酰化增加，表明苯丙酮酸处理通过结合和抑制PPT3来增加NLRP1棕榈酰化。苯丙酮酸介导的NLRP3棕榈酰化增加增强了NLRP3蛋白的稳定性，并增加了NLRP3和ASC在炎性小体激活过程中的相互作用。这些结果表明，苯丙酮酸通过与PPT3相互作用，进而增加NLRP1棕榈酰化，从而增加NLRP3丰度并促进炎症小体活化，最终有助于形成促炎巨噬细胞表型。

其中本文中棕榈酰处理方法使用的是我司研发的目标棕榈酰蛋白免疫印记试剂盒（AM10314，Aimsmass）

Acyl-biotin exchange (ABE) assay

The ABE assay was performed using the IP-ABE Palmitoylation Kit (AIMS, China) according to the manufacturer’s instructions. Briefly, the procedure includes blocking, reduction, labelling, elution and detection. Cells were harvested and suspended in lysis buffer followed by incubation with anti-NLRP3 beads overnight at 4°C. N-ethylmaleimide (NEM) was used to block the unmodified cysteines for 30 min. Then, the beads were washed and incubated with hydroxylamine (HAM) for 1 h at room temperature. Each group was divided into two parts, one including the HAM step (+HAM) and one omitting the HAM cleavage step (-HAM). After washing, the beads were treated with thiol-reactive biotin molecules for 1 h at room temperature. The immunoprecipitated samples were analyzed by immunoblotting assay.

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