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人ErbB2转录因子1或ErbB2-1 (TOB1)基因的换能器在抑制肿瘤的增殖、侵袭和转移中发挥重要作用。在肺癌、甲状腺癌、乳腺癌和皮肤癌中，称TOB1基因表达减少。在乳腺癌中，TOB1基因在MCF-7细胞中具有诱导凋亡的作用，TOB1可增加MDA-MB-231乳腺癌细胞对辐射的敏感性。TOB1可通过负调控c-myc表达、阻断PI3K/PTEN信号通路等多种途径抑制肿瘤细胞增殖。肿瘤抑制蛋白TOB1磷酸化的增加可能促进胃癌的进展。

研究人员使用胃粘膜上皮细胞系GES-1和三种胃癌细胞系(HGC-27, AGS和MKN-1)。与对照组相比，经WB 检测，胃癌细胞中TOB1蛋白水平降低，而磷酸化的TOB1蛋白(p-TOB1)水平升高。

TOB1在胃癌细胞系中的磷酸化情况

S-亚硝基化也称为S-亚硝化，是硝基离子（NO+）共价结合在半胱氨酸上，相当于形成了一个硫醇的形式。

PhosphoSite-Plus软件被用来寻找phosTOB1的构造状态(图1),在已知的磷酸化网站主要是来自报告数据分析的低通量(LTP)和高通量(HTP)的检测,如磷酸化TOB1可能出现在多个位点,我们随后研究了磷酸化位点的TOB1胃粘膜上皮细胞系GES-1和胃癌细胞株HGC-27 AGS和MKN-1。

图1

用WB检测了TOB1和p-TOB1的蛋白水平，结果显示，在三种恶性细胞系中，p-TOB1的水平(图2)高于胃黏膜细胞，尽管在胃癌细胞中，TOB1总蛋白水平较低(图2)。

图2

鉴定TOB1的磷酸化位点情况

为了确定表达pTOB1的细胞系中的磷酸化位点，我们先通过IP富集TOB1蛋白（图3），利用IP特异性抗体，通过WB在四种细胞系中鉴定了TOB1蛋白表达(图3)，并在IP结果中发现了TOB1蛋白表达(图3)。对IP后洗脱液中的蛋白质进行烷基化、酶解、脱盐、沥干、溶解，并用LC-MS/MS分析。随机的蛋白质降解成多肽分子量不同进行磷酸化肽段分析（图4)。结果在分析目标蛋白的氨基酸苏氨酸172和320 (T172,图4)和丝氨酸(S320,图4 )有磷酸化修饰位点。

图3

ProteinPilot软件序列覆盖窗格中目标蛋白肽段的覆盖情况如图4C所示。MS共检测到5个肽段，置信度为> 95%，这些肽段含有2个磷酸化的肽段，即T172和S320位点在PhosphoSitePlus中未见报道，但已被软件预测。因此，TOB1的T172和S320位点在MKN-1胃癌细胞中被磷酸化。

图4

Disulfide bonds

研究人员推测TOB1可能在胃癌的多个部位发生磷酸化。因此，我们用LC-MS/MS检测分析了三种胃癌细胞系TOB1的磷酸化位点，其p-TOB1水平高于正常的gs -1细胞。我们检测到两个新的磷酸化位点，T172和S320，这与在软件上的预测一致，目前还没有报道。根据预测结果，TOB1可在多种氨基酸上磷酸化;然而，LC-MS/MS在MKN-1胃癌细胞中只检测到两个磷酸化位点。由于质谱是一种shotgun蛋白质组学方法，所以实验结果可能不完整。蛋白质磷酸化和去磷酸化是动态的可逆过程，细胞的生理状态在不同的时间点影响磷酸化。

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磷酸化位点鉴定