蛋白标记手段在研究和辨别蛋白发生修饰类型实验中有重要作用。

此篇介绍的是被称为肉豆蔻酰化的蛋白翻译后修饰位点，肉豆蔻酰化是一种由肉豆蔻酰CoA（后文简称NMT）催化的反应，将肉豆蔻酸（C14饱和脂肪酸）转移到蛋白质N端的反应。大肠杆菌是内源性不含有NMT，用来共表达NMT和被标记的目标蛋白，含有一个可以进行豆蔻酸反应的“点击”标签，此标签是一个功能集团，可以通过“点击”化学反应，例如叠氮化合物，可作为体外特异性位点标记的“手柄”。在此方法中提供了体内重组蛋白N端标记的实验方案，以及通过点击化学方法，可对蛋白进行亲和纯化和荧光检测。除了一般的N端蛋白标记外，此方法还可以用于研究相关蛋白本体豆蔻酰修饰，NMT酶的特异性，整个方法都无需放射性同位素。

图1

通过采用特异性和选择性方式标记蛋白质的手段是非常实用的，当然能够通过这样的方法确认蛋白所发生的修饰位点也是同样的。比如糖基化修饰、生物素结合、异戊二酰化、胆固醇化、磷酸化和脂质化等。此文中的方法采用了实用细菌作为转移酶表达的容器，随后目标蛋白和体内的天然小分子转移酶底物的化学标记模拟，如图1所示。此方法中可在目标蛋白N端添加一个氨基酸多功能亲和荧光标签，在生物化学的许多研究领域都大有用处。

肉豆蔻酰化

肉豆蔻酰化属于较大分子量的蛋白翻译后修饰类型，在NMT的催化下，蛋白N端的甘氨酸与肉豆蔻酸发生不可逆反应，形成结合。NMT与一组特定靶蛋白N端氨基酸残基结合，此处残基已经被鉴定为一种典型的基序，尽管存在某些氨基酸变异，也可能会阻止或促使其他部分发生该修饰。NMT的另外一个底物是肉豆蔻酰辅酶a硫酯，由细胞内的酰基辅酶a合成酶生产。在真核生物中，豆蔻酸盐是通过共翻译引入的，当蛋白水解消化后产生一个新的N端甘氨酸，脂化促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以及与转运和信号转到相关的膜蛋白之间的相互关联。

采用酶标记和生物化学反应标记

在体内和体外进行化学反应最大的挑战是化学反应的多样性，与目前所了解的生命系统中发生正交生物反应的官能团少之又少，这是阻碍此领域研究的发生的一个障碍，生命系统中发现的可发生反应的官能团也大都在反应体系中比较稳定。

方法学的优势

一个简单的例子就是蛋白酰基化包括氘标记的肉豆蔻酸在内，均可通过SDS-PAGE分离蛋白质后进行放射自显影，然而为了安全和成本考虑，放射自显影可能需要数小时甚至更长的时间，相比较之下，凝胶内荧光成像只需要几秒钟，而且成本很低。荧光蛋白可以通过遗传方法被整合到感兴趣的蛋白中，但是这些蛋白质体积通常较大（通常＞10Kda），这意味这可能会干扰蛋白质的功能。

蛋白翻译后修饰的标记手段，特别是带有亲和标签的那种，使得标记底物被引入细胞和组织后，可以对其目标结合蛋白进行富集和相关蛋白质组研究。这种方法已经作为一种通用的特定手段研究重组蛋白，并且提供便捷的方法研究蛋白翻译后修饰位点。比如甲酰基甘氨酸生成酶，生物素连接酶和NMT的相关应用。

方法学的限制

此方法的实现必须能够对感兴趣蛋白进行标记，并且此蛋白必须是NMT的底物。所研究蛋白都是已知能够发生肉豆蔻酰化并且在蛋白N端有可发生肉豆蔻酰修饰的序列（MGXXXS/T(K))。那么对于一些N端参与部分下游生物学功能的蛋白质，此方法也是不能兼容的。

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