特殊名词：

AP-MS 亲和纯化-质谱联用

PPIs   蛋白质-蛋白质相互作用

on-beads 对亲和珠子上结合蛋白直接进行酶切处理

elution-digestion 洗脱后溶解内进行消化

mass spectrometry interaction statistics(MiST)  质谱相互作统计

on-bead digestion in ammonium bicarbonatebuffer  ABC法

on-bead digestion in trifluoroethanolbuffer         TFE法

two-step digestion in urea buffer                  Urea法

SDS elution with filter-aided samplepreparation (FASP) SDS-FASP法

SDS elution with SDS-PAGE and in-geldigestion      SDS-Gel法

亲和纯化-质谱联用技术（后简称AP-MS）已然是发现自然状态下蛋白与蛋白相互作用的首选办法，AP-MS的成功依赖于胰蛋白酶消化效率和胰蛋白酶消化后肽段的回收。在AP-MS研究中并没有系统性的研究胰蛋白酶消化条件对PPIs（蛋白质相互作用）尚未进行系统的研究。此文使用NFκB/RelA 和Bromodomain-containing protein 4 (BRD4)作为诱饵并测试5种不同胰酶蛋白酶消化方法（两个是“on-beads”，三个是“elution-digest”）

尽管胰蛋白酶消化方法的效果会因使用的诱饵蛋白、抗体和细胞系的不同略有变化，但是我们发现elution-digest方法始终优于on-beads这个方法。这5种方法均可普遍识别高丰度相互作用蛋白，但胰蛋白酶消化方法的选择对低丰度相互作用体的识别有显著影响。

胰酶法的分析蛋白互作流程

通过使用MS质谱技术对细胞IP后裂解液分析表明，裂解液中93%的RelA被抗体富集下来，表明亲和纯化作用的高效性（图1B）。为了确定方法的重复性，通过对蛋白丰度值取log2进行两两分析，Pearson相关系数（r2）范围在0.90~0.97之间，具有较高的一致性。（图1C）

不同的消化方法产生的多肽和蛋白鉴定数量有显著差异（图1D，E），分别用ABC方法，TFE方法、尿素法、SDS-PAGE法和SDS-gel法，分别鉴定出来的蛋白为1011、 1180、 1636、1586和1267个。

图1

RelA相互作用蛋白

采用ABC法、TFE法、尿素法、SDS-FASP法和SDS-gel法分别对30、44、52、114和58个RelA相互作用蛋白进行了分析，结果如图3A所示。

相对于这些蛋白的MS强度，RelA相互作用蛋白数量的直方图表明，ABC法比其他方法识别出更多的高丰度RelA相互作用蛋白，而SDS-FASP比其他方法识别出更多的低丰度RelA相互作用蛋白（图2B）。通过对互作蛋白进行差异分析，发现左右方法共有蛋白是13个（图2C），当然NFKBIA, NFKBIE, NFKB1, TIMM23 and TRIM21这5个蛋白相对于IgG是真实与RelA发生作用的（图2D），当然不同酶解方法对于非特异性互作蛋白的酶解没有显著的区别（图2E）。

 图2

比较不同胰蛋白酶消化方法对RelA互作蛋白的AP-MS分析

通过对MiST打分的分析，我们可以更详细地比较每种方法的性能。令人惊讶的是，ABC方法识别的RelA交互作用的平均MiST得分最高（3A），在30个RelA互作的蛋白中有21个的MiST得分超过0.9，同样的SDS-FASP法鉴定的的RelA相互作用蛋白平均MiST打分最低，只有28%（32 outof 114）。并且在3B和3C中，ABC方法具有较高的MiST再现性，而SDS-FASP在全部的检测方法中最低。这个趋势与2B中的直方图分析一致，ABC方法识别的RelA相互作用蛋白的MS平均信号（3D中）高于其他方法识别的RelA相互作用蛋白。

图3

含溴域蛋白4（BRD4）互作蛋白组

不同的胰蛋白酶消化产生的蛋白质鉴定数量显著不同（4A）。分别采用ABC法，TFE法、尿素法、SDS-PAGE法和SDS-Gel法分别定量了927、864、1008、977和405个蛋白。采用ABC法、TFE法、尿素法、SDS-FASP法和SDS-Gel法分别鉴定出99、73、112、50个BRD4相互作用蛋白。（4B）通过对5种不同的胰蛋白酶消化方法鉴定后的韦恩图进行分析，发现所有方法鉴定的19种蛋白一致（4C）。与RelA相互作用蛋白研究结论一致，洗脱-消化法鉴定出更多的低丰度BRD4相互作用体（4D）。我们用网络表示（4F）绘制了本研究中确定的277个BRD4相互作用体。

图4

综上来说，与直接on-beads消化相比较，胰蛋白酶从beads上直接洗脱下来得到的RelA互作蛋白丰度较高，并且SDS作为洗脱缓冲液优于尿素。为了在胰蛋白酶消化前去除SDS，通常采用两种方法：FASP溶液内酶解和SDS-PAGE胶内酶解。数据显示FASP溶液内酶解效果要优于SDS-PAGE胶内酶解。

洗脱-消化法(SDS-FASP法和尿素法)比on-beads消化方法所得的互作蛋白覆盖路更高；SDS-FASP法优于尿素法。胰蛋白酶消化方案的性能可能随着采用的诱饵蛋白、抗体和细胞系不同而不同。诱饵蛋白与互作蛋白之间的亲和力、复合物内互作蛋白的定性以及胰蛋白酶肽的富集也可能影响胰蛋白酶消化方法的性能。

本文介绍大概几种不同质谱分析前样本处理方法的区别，比较过程中还有其他角度的实验和分析，限于篇幅只选取结论相关部分展示。

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