此文1400字，阅读需要6分钟。

谷胱甘肽是一种小的三肽(c- l-谷氨酰胺- l-半胱氨酸-甘氨酸)，以还原形式(GSH)或氧化形式(GSSG)存在，其中两个谷胱甘肽分子之间通过一个二硫键链接。谷胱甘肽通常被认为是维持细胞内还原环境中的氧化还原缓冲液，它保护许多类型的细胞免受活性氧（ROS），外源物质，以及重金属的伤害。例如在植物中，谷胱甘肽同样参与许多重要的生物学过程，包括开花, 细胞分化，细胞程序性死亡，病原体耐药性，共生和细胞周期。

最新研究表明，谷胱甘肽也参与翻译后修饰即谷胱甘肽酰化，蛋白巯基化反应是在小分子量的硫醇和半胱氨酸硫醇之间形成可逆的混合二硫化物，由于谷胱甘肽是目前为止细胞中含量最丰富的低分子量硫醇，因此谷胱甘肽酰化是S-巯基化的主要形式。这种修饰显然主要发生在氧化应激条件下，但在正常条件下也可能很重要，特别是对几种硫醇过氧化物酶的再生，导致体内蛋白发生谷胱甘肽化的确切机制尚不明确。谷胱甘肽酰化可以保护半胱氨酸硫醇不被不可逆氧化成亚磺酸或磺酸，但也可以改变蛋白的极性和活性。因此，谷胱甘肽酰化可能是一个重要的氧化还原信号可使细胞感知有害的压力信号的机制条件和触发适当的响应。谷胱甘肽酰化已被许多研究证明参与调节诸多信号转导通路。在哺乳动物中，NF-kappaB通路似乎受到谷胱甘肽酰化的调控，谷胱甘肽酰化也报道影响许多蛋白激酶的活性和磷酸酶活性。 考虑到谷胱甘肽化潜在的重要性在压力反应和适应方面有许多方法用于鉴定和分析谷胱甘肽化蛋白质。这些方法都是通过体外纯化蛋白的分析进行大规模的蛋白质组学研究，可鉴定出哺乳动物近200个蛋白靶点。在本文中，我们将详细介绍可用的方法用于谷胱甘肽话体内和体外蛋白的鉴定和分析。

谷胱甘肽化蛋白的检测大体上有两种主要方法；应用最为广泛的是基于标记谷胱甘肽的蛋白质组学技术，通过35S放射性标记或者生物素化。第二种方法是基于检测谷胱甘肽酰化蛋白而不标记谷胱甘肽池，例如使用谷胱甘肽抗体或晶GRXs脱谷胱甘肽后的硫醇烷基化。

³⁵S放射性标记法

放射性标记谷胱甘肽是一种简便的分析谷胱甘肽化蛋白的技术手段。此方法非常灵敏并且能够进行定量检测。谷胱甘肽和蛋白质半胱氨酸之间容易形成混合二硫键，通过化学还原剂如DTT将其还原。因此，采用DTT对放射性样本进行处理确认标签确实与谷胱甘肽链接，在体外，个别蛋白质的谷胱甘肽化可通过3H-GSH进行分析。

图1

目前最常用的标记是通过³⁵S-半胱氨酸对谷胱甘肽池进行标记，如图1。第一步是需要抑制环乙胺的蛋白合成，然后在³⁵S-半胱氨酸的存在下进行孵育。因此，在抑制蛋白质合成的条件下，³⁵S-半胱氨酸将作为主要的谷胱甘肽分子一部分，在初始标记步骤后，细胞放置在氧化应激条件下，一般是添加体外氧化剂等，促使蛋白发生S-硫醇化。在此步骤之后，在非还原性的条件下提取分离蛋白质通过1D或2D-gel电泳。硫醇化蛋白在凝胶干燥后可通过自显影或荧光成像技术显示。DTT处理放射性样本会使放射性信号消失，从而证实这个标签确实与S-硫醇化反应有关。

然而，35S-半胱氨酸标记法有几个主要缺陷，主要问题在于必要的蛋白合成抑制剂预处理将不可避免的干扰细胞生理。此外，尽管谷胱甘肽酰化被认为是主要的S-硫醇化反应，但是这种方法不能区分S-硫醇化的类型。

另一个限制是需要进行2D凝胶来可视化S-硫醇化蛋白，二维凝胶的负载极限有利于丰富蛋白质的鉴定。

虽然在二维电泳前对提取液进行分馏可以克服这一问题，但这种方法可能无法识别低丰度蛋白，³⁵S-半胱氨酸标记即便有许多局限性和缺点，但它可以对大多数S-硫醇化蛋白进行鉴定和分析。此方法适用于细胞培养中丰度最高的S-硫醇化蛋白的鉴定，而其他方法适合于低丰度蛋白的分析。

生物素化谷胱甘肽

生物素谷胱甘肽在体外可以还原型BioGSH或氧化型BioGSSG的形式合成，谷胱甘肽乙酯（GEE）又称还原型谷胱甘肽类似物，可被用于产生透膜形式的生物素化谷胱甘肽（BioGEE）。上述所有的合成都是基于水溶性生物酰化制剂磺丁酰亚胺-6乙酸盐（Sulfo-NHS-Biotin），如图2A；然而，当此生物素酰化试剂与还原型谷胱甘肽偶联后，它能与谷胱甘肽的硫原子发生反应，减少游离硫醇生物素化谷胱甘肽的总量，如图2B。氧化谷胱甘肽这种情形，存在GSSG的两端的两个主要氨基酸，导致两个生物素片段结合为GSSG分子，如图2C。

图2

由此产生的生物素化谷胱甘肽分析可作为氧化剂诱导的S-谷胱甘肽化有效标记物。谷胱甘肽上生物素集团的存在可通过用商业化的聚合链霉素亲和酶或生物抗体，并结合非还原WB手段检测蛋白上的谷胱甘肽化修饰。生物素标记的谷胱甘肽也可以在体内用于谷胱甘肽化蛋白的蛋白质组学鉴定。当使用BioGSSG时，它模拟氧化应激的一个确定组成部分，即谷胱甘肽化还原偶联向氧化二硫状态转变，相比之下，BioGSH和BioGSSG不诱导氧化应激，它们与氧化剂如二胺或过氧化氢联合使用。生物素标记的蛋白可在亲和素偶联的琼脂糖珠进行亲和纯化。用洗涤剂缓冲液洗涤后，蛋白质通过与生物素化谷胱甘肽形成的混合二硫键与亲和素结合，可通过还原剂（如还原DTT或β-巯基乙醇）孵育进行洗脱，并通过质谱法进行鉴定。

与³⁵S-半胱氨酸标记方法相比，基于生物素的谷胱甘肽蛋白质组学分析方法具有许多优点。首先，在氧化应激处理过程中不需要抑制蛋白质合成，其次，该方法只检测谷胱甘肽化蛋白，而不检测所有的S-巯基化靶点，第三，亲和纯化非常特异，克服了2D凝胶电泳的局限性。可在2D凝胶上对谷胱甘肽化蛋白而非总提取物分析目的蛋白，从而检测到数量明显较少的高丰度蛋白。另外，洗脱后的蛋白质也可以通过高灵敏度和高通量的蛋白质组学方法，如nano-LC-MS/MS进行分析。最后，生物素标记感兴趣的蛋白质可通过许多种方法检测，如使用或者不使用生物素抗体或HRP-avidin进行免疫沉淀的免疫印迹或亲和纯化，或使用荧光显微镜进行细胞定位。

除了有这些优点，但用这种方法所鉴定到的谷胱甘肽化蛋白比³⁵S-半胱氨酸标记法要少的多。当然基于生物素化谷胱甘肽的方法的主要缺点是谷胱甘肽分子上存在大量的生物素标记，可能会干扰蛋白质与谷胱甘肽相互作用的功能，尤其是那些调控谷胱甘肽化发生的蛋白质。

谷胱甘肽抗体

谷胱甘肽化蛋白也可以用商业化的谷胱甘肽抗体进行检测，基于此种抗体的方法是非常具有前景的，因为可以克服³⁵S和生物素标记方法遇到的诸多问题。事实上，使用谷胱甘肽抗体，谷胱甘肽化蛋白可以在很多生理条件下进行分析，因为不需要额外的预处理，并可通过WB，1D或2D Gel，或者免疫沉淀，甚至通过免疫细胞定位等手段进行检测。总提取物中，谷胱甘肽抗体仅仅检测到少量的高丰度蛋白，基于这种抗体的每一项研究都只鉴定出4-5种高丰度蛋白质，例如HSP70或actin.

但是抗谷胱甘肽抗体的一个主要缺点就是抗体特异性，事实上谷胱甘肽是一种活性分子，无论是在溶液中还是在与蛋白质结合时，它都可能表现出数百种构象。因此，谷胱甘肽抗体的亲和力可能根据谷胱甘肽加和物的构象和硫醇化环境发生很大的变化。总的来说，目前可用的谷胱甘肽抗体可用于单个蛋白分析，但似乎不使用与蛋白质组学大规模探索谷胱甘肽化蛋白。

GRX对谷胱甘肽化蛋白的还原

GRXs是硫氧蛋白（TRX）超家族中的一种小的二硫氧化物还原酶，GRXs是第一个被鉴定为谷胱甘肽混合二硫键的还原酶，经典的GRXs具有CPYV活性位点，两个相邻的半胱氨酸形成谷胱甘肽可还原为二硫醚。这些GRXs可以催化蛋白质的二硫键的氧化还原和谷胱甘肽的脱硫。

图3

后者可以通过二巯基机制发生，包括在GRX的活性位点上形成二硫键，也可以通过单巯基机制发生，另一方面两个半胱氨酸都是二硫键还原所必需的，因此GRX单半胱氨酸突变仅保留活性最强的N端半管氨酸（CPYS）可以催化蛋白脱谷胱甘肽酰化，但不能再还原蛋白的二硫键。基于GRXs的性质，科学家们开发了一种通过GRX还原谷胱甘肽蛋白的鉴定方法，如图3所示。

蛋白提取物最初与NEM（N-乙基马来酰亚胺）进行大量烷基化，以阻断所有游离硫醇，经单半胱氨酸GRX还原后，通过NEM-biotin标签蛋白获得的硫醇标记在最初提取的谷胱甘肽化蛋白上。然后用亲和层析方法纯化这些蛋白，并按照上述方法用生物素化的谷胱甘肽进行蛋白质组学分析。这种方法可适用于多种生理条件下，此外，其主要优点之一是允许检测已经在基础条件下发生谷胱甘肽化的蛋白质。

其他方法

科学家们还提出了其他几种检测和鉴定谷胱甘肽化蛋白的方法，GST叠加法是基于日本血吸虫GST特异性结合谷胱甘肽换蛋白的谷胱甘肽集团的能力设计而成，此方法利用SDS-PAGE分离总提取物中的蛋白质，并与生物素标记的GST孵育，孵育后用化学显影的方法观察谷胱甘肽蛋白。还有一些一些研究通过固定的谷胱甘肽或者其类似物亲和纯化含有易发生谷胱甘肽酰化的半胱氨酸，虽然这些方法不能进行体内分析，但它们可能是基于放射性标记或者生物素化的谷胱甘肽技术的补充，可用于体外谷胱甘肽化蛋白的鉴定与分析。

 表1

迄今为止，尽管35S-半胱氨酸标记有一些缺点，大多数已知的谷胱甘肽酰化蛋白是用此方法鉴定出来的，以上所述的谷胱甘肽化蛋白的分析方法各有优缺点，是相互补充的，如表1。在将来，所有这些方法的组合以及新方法的发明对于进一步深入了解不同组织，不同细胞以及不同生理条件的谷胱甘肽化蛋白至关重要。

原文链接

AIMS---蛋白质谱服务商，提供快速便捷的 LC-MS/MS 蛋白定性/定量检测。