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泛素化是一种高度保守的多肽（76个氨基酸组成），可通过酶机制与底物蛋白结合，存在于所有真核细胞中。通过一系列的酶级联反应，通过E3或泛素连接酶将泛素部分转移到目标蛋白。泛素连接酶不仅可以将泛素偶联到靶蛋白上，还可以进行重复组装形成多聚泛素链。此多聚泛素链的化学性质决定其生物学功能，赖氨酸上48个泛素多聚链通过蛋白酶体促进底物的降解，蛋白酶体也是一种多聚蛋白酶复合物，泛素化蛋白被蛋白酶体水解的的过程在清除错误折叠蛋白中具有普遍作用，也是信号通路调控的一种常见机制。此外其他线性多聚泛素化也有参与信号通路的激活。

泛素化对细胞蛋白质稳定性和细胞功能有及其重要的影响，质谱法（LC-MS/MS）可用于分析出蛋白中特定氨基酸发生泛素化的位点及其结合的靶蛋白，然而蛋白质组分析所需的纯化是极具挑战性的。

此文中所采取的方法是一种双分子亲和纯化方案(bimolecular affinity purification , BAP)，用于分离特定的泛素化蛋白，其中含有与泛素和靶蛋白结合的亲和基团。与泛素发生偶联后，该蛋白靶向两个亲和标签，纯化得到该特异性的泛素化修饰形式的靶向蛋白。当然，为了避免裂解过程中的去泛素化发生或者互作蛋白的共同纯化，在蛋白变性后使用多组氨酸或生物素标签进行纯化的，利用此方法，可以高效地大量纯化特定泛素化蛋白，并且获得足够的量进行后续质谱检测，鉴定出蛋白中泛素化赖氨酸位点可以阐释清楚泛素化对该蛋白功能产生的影响。

氨基酸点突变可能导致泛素化减少或者缺失就像其他翻译后修饰一样，这些蛋白的突变形式可以用来检测泛素偶联是如何改变蛋白功能的。在大多数情况下，序列的分析解释了特定氨基酸的保存，用来检测（通过定点突变）是否是一个潜在的受体位点。

然而，并不是所有的目标都适合这种分析，需要更全面的方法来识别赖氨酸受体位点。质谱分析（MS）最新发展使直接识别受体位点的技术得以发展，这些技术依赖于胰蛋白酶消化泛素化蛋白后，泛素依然附着在靶蛋白上，从而产生114Da的质量位移，可用于识别与靶蛋白受体位点。当然进行质谱检测时候，是否能够检测到大部分的肽段在分析潜在的泛素化位点至关重要，否则未被质谱检测到的肽段可能含有泛素化位点，那么这些位点可能需要通过点突变的方法进行补充。考虑到质谱检测本身的特点，完全通过质谱获取全部的肽段序列是较为困难和极具挑战性的。虽然有一些限制性因素，但是可以通过对泛素化蛋白进行纯化则可以提高泛素化蛋白的检测覆盖率以及提高发现潜在泛素化位点可能性，纯化的方法也会因修饰位点的不稳定性和目的蛋白的丰度低导致鉴定失败，当然体外纯化虽然能获取大部分目标蛋白，但每次体外反应的很难标准化，而且细胞中反应体系与体外还有所不同，还会存在其他因素影响修饰位点或者多聚泛素化链的形成。

综上所有原因，此文中虽然质谱本身的缺点和限制性都存在，但是所采用方法能够纯化特定组分中的特定蛋白将大大提高质谱检测到泛素化位点的可能性以及拓展相关应用。

BAP法巧妙之详解

此种纯化方法可以纯化细胞中任意指定的泛素化蛋白，可称为串联亲和纯化或双分子亲和纯化（BAP）。纯化过程在充分变性条件下进行，需要在结合和洗脱过程中改变各种条件。第一次纯化是把所有的泛素化物质全部纯化出来，第二次纯化则是把目标蛋白从第一步纯化的泛素化物质中纯化出来，可获得目标蛋白的泛素化形式，多数情况下，所纯化的蛋白只占全蛋白非常小的一部分，如图1所示。

图1

此种方法也面临不同的挑战，第一就是会从细胞裂解液中提取大量的泛素化蛋白，这些泛素化相对不稳定，可被各种泛素水解酶裂解后去泛素化。这些酶可被特定的抑制剂灭活，例如泛素化乙醛、NEM以及8M尿素。个别泛素化蛋白较难溶解，那么通过含有8M的尿素也可以完全解决。

另外一个挑战就是通过利用了亲和基团His-tag和生物素标签使得纯化能在完全变性条件下进行，这两种标签均可以在完全变性的环境下进行纯化。当然考虑到生物素-链霉亲和素相互作用的极高亲和力以及几乎不可逆的结合步骤。因此，为了洗脱目的，在生物素标签和靶蛋白之间增加了TEV蛋白酶位点，可在图2a 中看到TB或者BT的序列。

图2

考虑到标签位置对功能的影响，此处特别使用了多聚组氨酸标签泛素蛋白的N端，以及TB标签在蛋白的C端，因为泛素只可以在N端进行标记，如果在C端的标记将占据它N端的泛素末端氨基酸的羧基，此羧基是泛素结合所必须的集团。并且C端是水解酶切位点，任何其他标签放在此处都是不稳定的。在细胞内，N端的标签通常不能被充分的生物酰化。随后将所获取的泛素化蛋白过镍亲和柱，完全清洗后泛素化的组分从珠子上洗脱下来，随后再过链霉素亲和柱结合靶蛋白。最终用TEV酶从链霉素亲和柱子上将蛋白洗脱下来。

BAP方法的应用

此操作方法大概需要2天能够完成，并且适用于大多数实验室。并且相信此技术很容易应用在许多靶向的蛋白中。为避免非生理泛素化的影响，靶蛋白的表达水平至关重要，因此需要根据实际情况，具体问题具体分析。BAP此方法不需要高外源泛素表达，因为内源泛素与标记的泛素行程聚合链并不影响后续纯化过程。然而我们知道的是外源泛素表达增加通常会促进许多目标发送泛素化，说明某种程度上说，泛素在体内可应用的量也是有限的。

因此，即使是外源性泛素的适度表达也可能确保某些外源泛素结合上靶标蛋白。即便是采用BAP纯化结合质谱的方法进行分析，也是要通过其他方法进行后续验证的。主要是通过对结合位点突变后的蛋白进行泛素化程度分析，如果发现蛋白泛素化未发生，则说明此位点明显是潜在修饰位点。虽然可以根据不同实验具体情况进行调整，但是此方法不失为一种研究蛋白泛素化功能的普适方法。

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