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膜蛋白在信号转导，离子转运和细胞黏附过程中发挥重要作用，与膜蛋白互相作用的蛋白起着重要调控作用，近些年科学家已经广泛使用质谱手段（LC-MS/MS）来鉴定膜蛋白结合蛋白。与可溶性蛋白不同，鉴定这些膜蛋白复合物需要使用去污剂，膜蛋白在去污剂作用下容易解折叠，聚集。那么这会导致原来的蛋白结构发生变化，蛋白间互作与生物学功能发生破坏。

M. D.Anderson Cancer Center和Cold Spring Harbor Laboratory的科学家做了相关研究，探究了不同去污剂对膜蛋白Cad11互作蛋白鉴定的影响。

什么？选择去污剂也有这么多猫腻？下面且听小编给您娓娓道来。

有这么玄幻？去污剂不同会影响IP结果？

为了探究几种常用的去污剂对Cad11蛋白复合体的影响，作者将培养细胞中的Cad11溶解在含有不同去污剂的溶剂中，并评价Cad11抗体结合Cad11蛋白复合物的能力，以及用iTRAQ质谱法分析Cad11蛋白复合物中相关蛋白。具体实验大致流程见下图。

图1

随后作者采用了表达Cad11蛋白的PC3-mm2细胞株，在开展免疫共沉淀实验之前，还对不同方法获取细胞进行了研究，发现通过胰酶消化下来的细胞，Cad11蛋白发生降解，，推测可能是由于胰酶中EDTA影响，在钙离子缺失情况下易发生水解。所以后续实验都是采用刮取细胞后降解，且所有免疫共沉淀实验缓冲液都不含有EDTA，见图1B。

作者最先探究了十二烷基-β-D-麦芽糖（DDM）和辛烷基葡萄苷（OG）两种去污剂对Cad11免疫印迹的影响。图2A中显示两种去污剂并未影响mAb5BH对Cad11的WB检测效果，而在图2B中mAb1A5抗体从含有DDM的裂解液免疫沉降结合Cad11，但并未能从含有OG的裂解液中拉下Cad11蛋白，同时排除了其他因素的影响，去污剂的不同竟然对Cad11蛋白的复合物产生构型变化，导致不同的检测结果。

图2

那么常用的其他7种去污剂会不会有影响?

常用的去污剂有聚氧乙烯月桂醚（Briji35），胆酸钠，曲拉通X-100（TritonX-100），丙磺酸盐（CHAPSO），Big CHAP，ZWITTERGEN 3-12和毛地黄皂苷（digitonin），而DDM作为阳性对照。WB结果显示这些去污剂均不会影响mAb 5B2H5与蛋白Cad11的结合，在图3A中发现含Briji35组中GAPDH含量相对较低，可能是因为Briji35无法有效溶解细胞PC3-mm2的蛋白，或者引起蛋白沉淀在离心过程中损失。

随后又探究Cad11相互作用蛋白在不同去污剂的影响下是否产生变化，包括β-catenin, p120-catenin, and clathrin，除Briji35之外，β-catenin在其他组均有表达，尽管使用的去污剂不同。同样也检测了p120-catenin蛋白，如图3A。

图3

相比之下，我们在每一组裂解液中都没有检测到clathrin蛋白，表明其抗原决定簇可能已经变性亦或发生降解。

β-catenin 和p120-catenin是两种与Cad家族互作的已经蛋白，图3B中可以看出，β-catenin在除Briji35之外的所有去污剂组中检测到表达，说明这些去污剂并不影响其与Cad11的相互作用，还检测到p120-catenin蛋白在Big CHAP- and digitonin去污剂组与Cad11有微弱的结合，TtritonX-100中也有较弱的信号，而其他组均未检测到任何结合，表明Cad11互作蛋白β-catenin 和p120-catenin的保留对去污剂的变化较为敏感。

质谱分析去污剂对蛋白复合物的影响

随后作者采用了质谱方法鉴定含DDM的Cad11蛋白复合物，样本进行电泳后进行考马斯亮蓝染色，两个平行样本中都有相似的电泳条带，图4。

图4

LC-MS/MS分析后的结果，排除常见蛋白质，例如角蛋白，热休克蛋白，RNA结合蛋白，以及只鉴定到一个肽段的蛋白质。同时考虑到蛋白分子量和相对丰度，以此筛选手段发现，clathrin在Band1（分别找到16和9个肽段），Cad1在Band2（分别找到35和35个肽段），在band3中找到β-catenin和asycatenin，根据同样的筛选方法，T-complex蛋白在Band4中，分析了在57-60KDa左右，表1A。

Table 1. Proteins identified in the Cad11 immune complex. 

同样的方法对下面的泳道进行分析，发现Flotillins蛋白包括FLOT1和FLOT2，在47Kda附近，与IgG的重链位置较近，Prohibitins（PHB2和PHB）在Band6中，并且也发现了VDAC2也有对应的肽段检测到。有趣的是质谱结果检测到clathrin的重链和轻链，尽管在图3B中显示没有通过IP/WB的方法检测到相关信号。

进一步使用iTRAQ进行分析

作者又进一步使用了iTRAQ质谱手段去比较不同去污剂溶液中蛋白的丰度差异。用mAb1A5抗体结合不同去污剂DDM，胆酸钠或者TritonX-100的细胞裂解液，通过比较Cad11与对照组Briji35，DDM和TritonX-100的倍数分别是23.2和22.5，而磺酸钠的倍数最高13.3，如图5A显示，

图5

在DDM组中，蛋白复合物的相对丰度为：Cad11> β-catenin> γ-catenin> clathrin light chain> clathrin heavy chain>p120-catenin。

有趣的现象是，在TritonX-100组中，p120-catenin相对丰度水平较为高相对于DDM和磺酸钠组。此结果正好和图3B中的现象吻合，在TritonX-100中检测到p120-catenin，而其他组未能检测到。

随后，又分析了潜在的与Cad11互作的新发现蛋白T-complex，Prohibitin和VDAC2，在前面胶条质谱鉴定中也发现了它们，iTRAQ的结果也和前面质谱鉴定结果吻合，相对表达非高度是Briji35组的3-9倍，

Table2B，Common candidate Cad11-interacting proteins identified by LC-MS/MS of SDSPAGE gel slices and by iTRAQ approach

这些检测的蛋白丰度都都是相对于Briji35得出的，相对倍数大于5的蛋白都在图6中显示，还需要进一步的研究确认这些候选蛋白与Cad11相互作用。

图6

 此文主要研究了去污剂的蛋白互作的影响，估计大多数朋友都没有考虑到如此常见的去污剂还会影响蛋白互作的研究，想必平时大家都会根据实验室传统进行选择裂解液配方，或者购买商品化的裂解液，结果有时候非常理想，有时候又会是让人绝望，此处通过使用质谱手段，以及传统免疫学手段对不同去污剂情况下的候选互作蛋白的分析，发现膜蛋白的互作蛋白可能会因去污剂的不同而发生变化，给我们一种全新视角审视互作蛋白研究过程中出现的问题。

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