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韩科院ISME|铁竞争激动抗生素的生物合成-共培养状态下的生存之战

已有 2863 次阅读 2020-2-17 16:36 |个人分类:互作|系统分类:论文交流| 铁竞争, 抗生素, 共培养, 混合培养

1遇见/摘要

通过微生物共培养系统模拟生态环境对阐明微生物间相互作用具有重要意义。本文将Streptomyces coelicolor 和Myxococcus xanthus 进行共培养，发现M. xanthus 增强了铁载体(myxochelin)的产生，使得M. xanthus 主导了铁清除作用而S. coelicolor 经历了铁限制作用，这种铁竞争引发了S. coelicolor 中抗生素actinorhodin的生物合成并导致支链氨基酸降解，这暗示了产生各种前体的潜力，同时激活了新的抗生素产出系统。这种化学竞争而非物理接触诱发铁竞争并增加了其他链霉菌属中多个次级代谢产物生物合成基因簇（BGCs）的表达。本文阐明了触发次级代谢物生物合成的信号，这有助于了解代谢物在微生物群落中的生态作用，并为增加代谢物的工业生产提供理论依据。

Proposed microbial interaction between S. coelicolor and M. xanthus during coculture

背景1：铁是微生物生存的必需元素，而自然界中的铁元素大都以无机盐的形式存在于各种环境中。微生物为了自身的生长需求，就需要以各种方式将无机铁转化为有机铁。铁载体能螯合无机盐中的铁离子，随后在各种蛋白作用下供给于微生物的生长繁殖(更多内容详见文章底部往期推荐)。

背景2：链霉菌是土壤中普遍存在的革兰氏阳性细菌，链霉菌中次级代谢物并不直接参与其在原生生境中的自然生长。每个次级代谢产物的生物合成都会受到复杂的调控网络严格控制，以响应自然环境中的各种生物胁迫（如营养竞争，群体感应和物理相互作用）和非生物胁迫（例如压力，温度和盐度）。

2遇见/内容

在实验室无菌培养条件下，缺乏特定的环境刺激，很可能导致链霉菌中次级代谢产物BGCs没有被激活。激活沉默的BGC有多种方式，包括培养基优化，表观遗传修饰剂处理，诱变和基因工程(详见往期推荐6，阐述挖掘基因簇的方式)。尽管准确模拟自然环境具有挑战性，但两种或多种不同微生物之间共培养为了解链霉菌小分子化合物的生态作用提供了有效方法。鉴于微生物通讯的化学和分子复杂性，这为揭示微生物间相互作用机制提出了挑战。

本文为了阐明共培养过程中两种细菌相互作用的机制，将S. coelicolor 和M. xanthus 进行共培养研究。研究人员将二者在固体培养基上进行对峙培养(Fig1a)，观察共培养过程中二者的形态(Fig1a/d)。在接种后3，5，7和9天 (T1-4) 后采样进行RNA-Seq (Fig1b):发现涉及actinorhodin生物合成途径的基因上调(Fig1e)，涉及铁载体myxochelin生物合成途径和铁获取系统的基因上调(Fig1f)。研究人员同时计算actinorhodin/Myxochelin的生成量(Fig1c/g)，发现共培养状态下二者均有增加。

Fig. 1: Transcriptome analysis of S. coelicolor and M. xanthus under pure-culture and coculture conditions.

为了阐明actinorhodin/Myxochelin之间的关系，研究人员在添加了myxochelin A、纯培养和共培养的M. xanthus 的 cell-free提取物后，未发现S. coelicolor 的actinorhodin产量增加 (Fig 2a,b)。此外，研究人员将两种微生物进行了物理隔离的共培养，结果导致S. coelicolor 主动产生了actinorhodin (Fig 2c)。在铁限制的纯培养条件下，myxochelin的产量增加，而在含铁的共培养条件下，myxochelin的产量却降低了(Fig 2e,f)。在T3时，共培养的M.xanthus 胞内铁浓度比纯培养的高约两倍(Fig 2g)。共培养的S. coelicolor 的细胞内铁水平比纯培养条件下的低1.7倍(Fig 2h)。此外，本文还测试了其他金属离子的影响(Ca, Cu, Zn 等)。考虑到细胞毒性后，铁是唯一会随着浓度增加而降低actinorhodin产量的金属离子。在共培养条件下，M. xanthus 螯合的铁显然超过了其生长所需的铁，而S. coelicolor 处于细胞内铁水平降低和抗生素生成增加。这些结果表明铁载体myxochelin的上调导致了铁竞争，诱使了抗生素actinorhodin的上调。

Fig. 2: Effects of iron competition between S. coelicolor and M. xanthus on actinorhodin production.

为了检测铁限制条件是否会改变其他链霉菌中BGCs的表达，研究人员在铁限制条件下进行RNA-Seq。在八个链霉属菌的基因组预测的260个BGC中，有76个BGC在正常或铁限制条件下表达，而21个BGC的表达在铁限制条件下特异性上调(Fig 3a)。在预测的由非铁载体BGC产生的次级代谢产物中，actinorhodin和cosmomycin D是具有相似骨架结构的芳族聚酮化合物，chloramphenicol是一种非核糖体肽型代谢产物(Fig 3b)。尽管需要进一步分析，但如果这些代谢物同时具有抗生素和铁螯合功能，则在与其他微生物竞争铁的过程中产生这些代谢物将对链霉菌具有很高的生长优势。

Fig. 3: Activated smBGCs from eight Streptomyces species under iron-restricted culture conditions.

在纯培养和共培养条件中，SCO6666在所有四个时间点之间的表达变化最高，而在铁限制条件下很少表达(Fig 4a,b)。有趣的是，抗生素BGC中的SCO5083和SCO5084在纯培养，共培养和铁限制条件下都很少表达(Fig 4c)。为了验证SCO6666在抗生素产生或输出中的功能作用，本文使用CRISPR/Cas9敲除系统构建了缺失菌株(Fig 4d)。与野生型菌株类似，SCO6666缺失株在纯培养条件下不产生抗生素，且在共培养过程中产生的抗生素也减少了(Fig 4e)。用SCO1797启动子构建的SCO6666过表达菌株在纯培养条件和铁限制条件下会主动产生抗生素(Fig 4f)。另外，在共培养和纯培养条件下，将SCO6666过表达载体引入SCO6666缺失菌株构建的互补菌株表现出与SCO6666过表达菌株相同的表型(Fig 4e,f)。表明SCO6666在共培养条件下以铁独立的方式被激活，并通过与抗生素BGC相互作用而在抗生素产生中发挥重要作用。

Fig. 4: Iron-independent transcriptional activation of novel genes involved in actinorhodin production during coculture.

自然界纷繁多变，生态系统复杂且难以阐述，通过微生物共培养系统模拟生态环境对阐明微生物间相互作用具有重要意义。本文研究表明，关键离子的缺失与否刺激了特定的BGC，这增强了链霉菌中次级代谢产物的生物合成。研究人员阐述了由代谢产物控制的微生物相互作用，这种精确表征为揭示尚未开发的生态系统提供了实验基础，并为改善代谢产物的工业生产提供了准确的选择压力。