原来我们的肠道菌群也可以自己产生药物！问题是怎么发现呢？

吴崇明 中国医学科学院药用植物研究所 chomingwu@163.com

肠道微生物蕴含着超过200万种基因，理论上具有极其复杂的代谢通路，因此是一个巨大的独特化合物池，可以作为新型药物的重要源泉。肠道菌群可以产生大量人体无法形成的代谢产物，如短链脂肪酸、维生素、多不饱和脂肪酸、寡糖和分泌蛋白，同时还可能产生各种神经递质和神经活性物质。这些代谢产物可以通过群体感应分子(quorum-sensing molecules)或直接作用于药理靶标而产生无数的功能。(注：群体感应是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性的变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征。其原因在于，当微生物种群密度达到阈值，信号分子的浓度也达到一定水平，通过包括受体蛋白在内相关蛋白的信号传递，诱导或抑制信号最终传递到胞内，影响特定基因的表达，调控微生物群体的生理特征，如生物发光、抗生素合成、生物膜形成等。)

然而，目前为止，人们对细菌调节宿主的分子机制尚知之甚少，如何从肠道菌群中发现新型药物还基本上处于毫无头绪的状态。新近洛克菲勒大学顶级合成生物学大牛Brady教授利用生物信息学和合成生物学方法发现肠道菌群代谢产物N-酰基酰胺是G蛋白偶联受体的配体类似物，并可以调节肠道代谢激素和糖稳态，相关研究成果发表在Nature杂志上(Cohen LJ, et al.(2017) Commensal bacteria make GPCR ligands that mimic human signalling molecules. Nature 549, 48–53.)；梅奥医学中心的Kashyap教授利用传统药理学方法发现了肠道菌群的另一种代谢产物——色胺可以作为GPCR 5-HT4受体的配体，调节胃肠蠕动和分泌，因此可以作为肠蠕动疾病如IBS的治疗药物。(注：已知人体存在多种能够产生色胺的菌属，如杆菌、双歧杆菌、梭菌、埃希菌、乳酸菌和链球菌，这些菌属是否对于IBS的治疗具有潜在益处？另外，这些菌属是否会合成其它相关的化合物？)。这些工作为理解微生物来源的化合物通过靶向肠脑轴发挥药效提供了新思路。

（图片源自：Cryan et al. A Microbial Drugstore for Motility. Cell Host Microbe 2018, 23: 691-692）

文献一、肠道菌群产生GPCR配体

(Cohen LJ, et al.(2017) Commensal bacteria make GPCR ligands that mimic human signalling molecules. Nature 549, 48–53.)

1.      缘起

虽然肠道菌群被认为在维持人体生理机能中发挥重要作用，但是细菌影响宿主生理的确切机制仍然不清楚。细菌影响宿主的一个重要方式就是产生各种活性小分子，但迄今被鉴定的仍非常之少。因此，研究微生物组产生的小分子并鉴定与之互作的宿主受体，对于确定细菌与人体生理的相互关系具有很大帮助，并可能为新型小分子治疗药物的发现提供一个新的源泉。

2.      方法

作者先前利用功能宏基因组学发现肠道菌群产生的N-acyl-3-hydroxyglycines能够激活GPCR，提示人信号传递分子与微生物编码的代谢产物之间存在结构趋同性。（Note: 功能宏基因组学是Brady教授创立的，可用于从无法单独培养的环境或人体微生物组中发现活性代谢产物。这也是我目前正在着手进行的研究。关于功能宏基因组学我将做一个专题进行总结和研习）GPCR是最大一类膜蛋白受体并且是当前药物的最长靶点，而N-酰基酰胺，例如内源大麻素，能够通过与GPCR相互作用调节多种细胞功能，因此由不同酰胺头和酰基尾的组合构成的大量长链N-酰基酰胺可能是微生物编码的GPCR活性信号分子的一个大类。（Note: 内源大麻素是现今肠道微生物影响机体的一个非常热点的分子，但是哪些微生物能够产生大麻素？目前尚未全面了解，值得深入研究）

作者组合了生物信息学分析和人微生物组测序数据，通过靶向基因合成、异源表达和高通量GPCR活性筛选，鉴定了微生物编码的具有GPCR活性的N-酰基酰胺。这些结果提示，这些GPCR活性小分子和它们的相关微生物合成基因具有调节人体机能的潜力。

3.      过程

为了从人微生物基因组中鉴定N-酰基合成酶(NAS)基因，作者首先用689个具有N-酰基合成酶蛋白家族PFAM13444的NAS基因对人微生物组计划(HMP)序列数据进行Blasn检索，得到了143个独特的人微生物组N-酰基合成酶基因，可以分成4组。

图1. 微生物组中的NAS基因

随后，作者从中选择了44个分类学不同的NAS基因用于合成和异源表达。将44个基因转染E.coli，并用LC-MS分析每一个培养物的乙基乙酸提取物，得到了31个克隆特异性的峰。根据代谢产物的保留时间和质量，可以分成6个N-酰基酰胺家族：(1) N-acyl glycine; (2) N-acyloxyacyl lysine; (3) N-acyloxyacyl  glutamine; (4) N-acyl lysine/ornithine; (5) N-acyl alanine; (6) N-acyl serinol。其中长链N-酰基鸟氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺先前已经在细菌中有报道。

图2. 获得的独特N-酰基酰胺代谢产物

4.      NAS酶的特征

4.1 产物特征

进化树分析显示，来自相同分支或亚分支的NAS基因大部分编码相同的代谢物家族。人微生物NAS蛋白使用的最常见的酰基链是14-18碳单位，它们可以被β-羟基化或单不饱和化。

4.2 酶亚单位特征

三个NAS酶含有两个结构域，第二个结构域是氨基转移酶（预测催化甘油形成丝氨醇serinol）或者另一个酰基转移酶(预测催化转移第二个酰基)。

4.3 酶共线性特征

寻找NAS基因附近的基因出现情况，发现某些NAS基因毗邻预测编码酰基转移酶的基因。

4.4 基因产物的体内确认

在预测含有上述NAS基因的细菌培养物中，用LC-MS方法也找到了上述代谢产物，表明这些代谢物是细菌的正常代谢物。

4.5 NAS基因富集部位

相比于其它部位的细菌，上述NAS基因在胃肠道细菌中含量更加丰富，而且其代谢产物主要是第一类，即N-acyl glycine。

5.      N-酰基酰胺与胃肠道GPCR互作

从每个分类中分离主要的N酰基酰胺，并对240种人GPCR的活性进行测定，看抑制剂还是激动剂。最强的激动剂互作有：N-palmitoyl serinol激活GPR119(EC50=9μM)， N-3-hydroxypalmitoyl ornithine激动sphingosine-1-phosphate receptor 4 (S1PR4)(EC50=32μM)，N-myristoyl alanine激动G2A(EC50=3μM)。N-酰基酰胺与GPCR的作用具有特异性（图3a, b）。最强的拮抗剂有：N-acyloxyacyl glutamine拮抗PTGIR and PTGER4(Fig. 3c; PTGIR IC 50=15μM; PTGER4, IC50=43 μM)。PTGIR被N-acyloxyacyl glutamine特异性拮抗，而PTGER4被N-acyloxyacyl glutamine和其它N酰基酰胺拮抗(Fig. 3c).

图3. GPCR活性筛选

以上结果显示，微生物N-酰基酰胺靶向的GPCR位于胃肠道，并且与免疫细胞互作。这些GPCR已知影响多种功能，包括代谢（GPR119）、免疫细胞分化（SIPR4, PTGIR和PTGER4）、免疫细胞转运（S1PR4，G2A）和组织修复（PTGIR）。不过目前的数据尚不可能证明GPCR和NAS基因在特定的胃肠道部位共定位。

6.      细菌与人GPCR配体的相似性

人微生物编码的N-酰基酰胺与内源GPCR活性配体具有结构相似性。最清晰的结构和功能相似性是针对内源大麻素受体GPR119。内源GPR119配体包括oleoylethanolamide (OEA)和膳食脂质衍生物2-oleoyl glycerol (2-OG)。在异源表达实验中，作者分离了N-酰基丝氨醇的棕榈酰和油酰类似物，后者与2-OG的差异只是酰胺取代了酯，与OEA的差异只是存在额外的甲醇取代。

N-oleoyl serinol与内源配体OEA具有相似的GPR119激动能力(EC50为12 μM vs 7μM)，但最大激动能力是后者的2倍(Fig. 5a)。作者合成了N-palmitoyl的所有20种氨基酸衍生物，但每一种的激动能力都未能超过OEA的37% (Fig. 5b)。因此，为了产生更强力而特异性的长链N-酰基酰胺GPR119配体，需要由比简单地一个氨基酸N-酰基化更复杂的合成过程。因此，N-oleoyl serinol的合成需要偶联NAS结构域和氨基转移酶，以便从甘油产生丝氨醇。

此外，S1PR4的内源激动剂sphingosine-1-phosphate (S1P)和细菌的N-3-hydroxypalmitoyl ornithine/lysine家族激动剂具有相似的头部电荷。S1P的效力更强(EC 50=0.09 μM vs 32 μM)，但是细菌激动剂对S1PR4的特异性更高，因为细菌N-3-hydroxypalmitoyl ornithine不会激动S1PR1、2或3，而S1P能够激动全部4种受体。

图5. 细菌N-酰基酰胺激动GPCR的能力

7.      细菌GPR119激动剂的功效研究

7.1 细菌酰基酰胺对GLP-1释放的影响

GPR119激动剂(OEA, 2-OG)已知不仅影响糖稳态，而且通过GRP119依赖的激素释放调节胃排空和食欲。GPR119可以影响如下细胞的激素释放：enteroendocrine (GLP-1, GIP, PYY)和胰腺β-cells (insulin)。作者用小鼠肠道内分泌细胞GLUTag细胞研究细菌配体对GLP-1释放的影响，证明N-oleoyl serinol能够和OEA和2-OG相似地促进GLP-1的释放。

图6. 细菌N-酰基酰胺对GLP-1释放的影响

7.2细菌酰基酰胺对糖代谢的影响

由于GPR119配体与糖代谢密切相关，作者进一步研究了细菌N-酰基酰胺对糖代谢的影响。先前Chen等用基因修饰能够产生增强内源GPR119配体OEA前体的E.coli灌胃小鼠，并产生了抗糖尿病活性(Chen Z, et al.Incorporation of therapeutically modified bacteria into gut microbiota inhibits obesity. J Clin Invest. 2014 Aug;124(8):3391-406. doi: 10.1172/JCI72517. Epub 2014 Jun 24.)。内源GPR19配体的代谢效应被认为发生在肠粘膜，因为静脉注射OEA不能降低小鼠血糖。

作者对E.coli进行遗传操作，使之表达N-酰基丝氨酸合成酶(受IPTG诱导)，然后灌胃小鼠，灌胃1周后进行OGTT试验。发现处理组小鼠的血糖水平显著降低，并且小鼠血液中存在N-酰基丝氨醇。撤销IPTG诱导剂2周后，降糖效果消失。（Note: 细菌定植后如何检查无该菌的效应是一个很大的难题，作者使用IPTG诱导表达菌，巧妙地解决了这个问题。）

图7. 细菌N-酰基酰胺对血糖的影响

点评：肠道菌群与疾病的密切关系已经得到了良好的证实，肠道菌群已经被认作是一个重要的药物研发靶点。但由于肠道菌群的复杂性，基于肠道菌群的药物开发存在巨大的挑战。合成生物学大牛Brady教授开发了两种方法，从肠道菌群的代谢产物中寻找潜在的药物分子。这篇论文是其中一个，利用生物信息学方法基于已知的药物靶点，寻找新型药物分子。非常值得我们从事药理学研究的人的借鉴和学习！