如何发现对“证”的创新药物？

吴崇明  中国医学科学院药用植物研究所 chomingwu@163.com

概要：哈佛大学Umut Ozcan教授利用基因表达谱分析技术，通过与已知功能分子（化合物或基因、蛋白质）的基因表达谱进行比较，寻找并发现具有更优活性的药物分子，实现了针对“证”的药物发现和优化。他们利用该方法发现来自中药雷公藤的南蛇藤醇（Celastrol）和来自南非醉茄的醉茄素A（Withaferin A）能够抵抗内质网应激和提高瘦素敏感性，从而发挥减肥功能。相关研究成果发表在Cell和Nature Medicine上。他们的创新性在哪里？对我们的药理学研究有哪些启示？本文将逐一进行解读。

为了应对各种的疾病，我们需要发现各种新型药物。传统的药物发现策略主要有两类：一类是基于疾病的药物发现，即首先建立模拟某种疾病的细胞或动物模型，然后利用该模型筛选药物；另一类是基于分子靶点的药物发现，即首先确定与疾病密切相关的分子靶点，然后利用该分子靶点的表达或活性对化合物库进行高通量筛选。基于疾病发现药物的策略，其面临的一个问题是，虽然利用该策略能够获得对疾病有治疗作用的分子，但无法准确判断其作用机理，因此难以通过结构改造有目的地进行优化，提高其药效或者降低其毒性。而基于分子靶点发现药物的策略，其面临的一个问题是，针对单一靶点的药物可能只适合于与该靶点密切相关的特定病人群体，并且容易产生耐药性。

除了上述问题之外，许多疾病，如肥胖、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等，虽然病因复杂，而却有着某些共同的病理基础，例如胰岛素抵抗（IR）、脂质过氧化状态、内质网应激（ER stress）等。这些病理因素介于疾病与靶点之间，在一定程度上可以作为疾病的发病机理，但其自身又是由于多种已知或未知的基因和/或蛋白信号网络失调所导致的。这与中医的“证候”很相似，作为疾病的发病基础，某个“证”可能引发多种疾病。换言之，疾病是“证”在不同身体部位的表现。虽然“证候”是中医学的一个独特理论，但迄今为止，从分子层面发现调节“证候”的药物分子，尚未见报道。那么如何针对这些“证候”发现新型药物？以及如何根据“证候”对药物分子进行优化呢？哈佛大学Umut Ozcan教授开发的比较基因表达谱分析技术为解决这个问题提供了一种有趣的参考，非常值得药物学家，特别是中药研究人员进行借鉴。

（Note：1. 中医的“证候”与IR、ER stress等现代医学概念的相互关系值得深入探讨。以往“证候”研究多与具体的生化指标和蛋白靶点进行关联。但是，生化指标只是疾病的外在表现，属于“症”而非“证”；另一方面，“证”与具体某一种基因/蛋白的表达水平并不具有线性相关性。即“证”的改善可能伴随着某种蛋白和/或基因表达水平的升高、降低或者不变（与下文ER stress的论述相似）。所以，先前的关于“证”的现代化解释可能存在一定程度上的方向上的偏差，我们应当更加注重与高层次病因相关联。2. 中药现代化应当更注重对“证”药物的研发，这才真正体现中药的特色，也可能发现更优秀的新型药物。）

文献一、南蛇藤醇（Celastrol）可以治疗肥胖

Liu J, Lee J, Salazar Hernandez MA, Mazitschek R, Ozcan U. Treatment of obesity with celastrol. Cell. 2015 May 21;161(5):999-1011. doi: 10.1016/j.cell.2015.05.011.

1.      问题的提出

肥胖已经成为了全球性流行疾病，但迄今为止并没有较好的药物治疗方法。20多年前，瘦素的发现曾经为肥胖的治疗带来了曙光。但不幸的是，这个希望很快破灭了。虽然注射瘦素能够抑制食欲，但主要在偏瘦的正常人群中有效，肥胖患者体内的瘦素的水平实际是很高的，只是出现了严重的瘦素抵抗，导致给肥胖人注射瘦素并不能产生持续的减肥效果。虽然针对瘦素抵抗的药物研发已经开展了数十年，但迄今为止还没有发现任何能够改善瘦素抵抗的化合物被发现。究其原因，主要是瘦素抵抗的发生机制很复杂，迄今尚没有建立一个有效的药物筛选方法。因此，寻找能够增强瘦素敏感性的活性化合物具有极其重要的意义。一方面，为肥胖症的治疗带来新的希望；另一方面，可以确认瘦素抵抗通路能够成为减肥药物发现的新靶点。

2.      研究的突破口

内质网应激是导致瘦素抵抗和肥胖的重要因素。先前研究显示，敲除神经元中的X-box binding protein 1 (XBP1)会导致ER应激、严重的高瘦素血症和瘦素抵抗，以及肥胖。另一方面，过表达剪接形式的XBP1可以增强瘦素敏感性。同时，能够增强ER功能和降低ER应激的化合物如4-phenyl butyrate (4-PBA)和 tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)可以增强瘦素敏感性，只是效果非常微弱。因此，以ER应激为靶点，发现更优的ER改善化合物，就有可能获得能够增强瘦素敏感性的新型药物。

（Note：导致瘦素抵抗的原因很多，作者主要关注了ER应激，我们完全可以根据这个工作的核心思想，以其它因素为靶标发现其它可提高瘦素敏感性的药物）

3．研究的难点

导致ER应激的原因有很多，所以ER应激与单一基因或蛋白的表达水平并不是线性相关的，具有复杂的变化。例如，转录因子XBP1、内质网Ca²⁺ATP酶SERCA2B和化合物4-PBA都能够减轻ER应激，但是它们对ER应激关键分子Chaperones的表达水平却有截然不同的影响。XBP1能够提高Chaperones的表达，而SERCA2B对其表达没有影响，化合物4-PBA甚至相反会降低其表达水平。因此，依靠单一的ER应激相关因子不能真实评判某种化合物对ER应激的调节效果。

4. 解决的办法

既然单一因子不能准确评价ER应激，那就用一系列因子的表达谱进行表征，这样就可以减少Readout的错误率。另外考虑到，不同ER应激改善方法可能导致相关蛋白的表达水平出现升高或者降低两种截然不同的变化趋势，在评价时不再执拗于是升高还是降低，而是用表达水平变化的绝对值进行评价，这样就可以避免活性化合物被冤杀。

（Note：在绝大多数研究过程中，当我们观察对象指标变化时，往往过于强调变化的趋势（升高还是降低），超过了对变化绝对值的关注。ER应激的实例告诉我们，有时升高和降低可能代表了相同的目标指向（ER应激的改善），而变化的绝对值则表示作用的强弱，它才是更加稳定的评价指标。）

5. 药物发现流程

作者使用比较转录谱方法寻找具有相似功效的化合物。该方法的大体流程如下：（1）比较活性化合物(4-PBA)和对照溶媒的基因表达谱，获得与4-PBA药效相关的靶基因群；（2）用靶基因群建立基因阵列（基因芯片）；（3）设计绝对富集得分(absolute enrichment score)，用于表征不同处理条件下靶基因群的整体表达分布情况；（4）用化合物库处理细胞，通过芯片测定每种化合物对靶基因群的表达谱的影响，并计算其绝对富集得分；（5）根据绝对富集得分确定最佳的活性化合物。（Note：这个药物发现过程既可以用实际的细胞和动物实验来做，也可以单纯用计算机来做。完全可以通过生物信息学方法，利用各种开放库资源，进行新型药物的发现。这是生物信息学工作者的福音！）

图1. 用比较基因表达谱方法发现活性化合物的流程

5.1获得与药效相关的靶基因群

虽然4-PBA和XBP1S都能够缓解ER应激，但是4-PBA在没有XPB1的条件下也能够缓解ER应激，所以两者的作用途径不同。因为获得更加准确而全面的靶基因群，作者做了三重比较实验：正常小鼠用和不用4-PBA处理；ob/ob小鼠用和不用4-PBA处理；和ob/ob小鼠用和不用XPB1S处理。

通过尾静脉注射药物，并收集肝组织进行基因芯片分析。上面每种处理下，均选择50个上调和下调基因组成靶基因群。

图2. 三种处理条件下的靶基因群。左：4-PBA处理正常小鼠；中：左：4-PBA处理ob/ob小鼠；右：XPB1S处理ob/ob小鼠。

5.2利用靶基因表达群进行化合物筛选

随后，用此基因群对化合物库的每种化合物进行筛选。通过为这三种处理的每一个计算基因谱的绝对富集得分（药物组相对于溶媒组的倍数变化），将每种化合物的数据进行三维排列。发现Celastrol位于坐标的最右上角，是为活性最佳化合物。

图3. 筛库的绝对富集得分

随后，作者设计了新的参数，用来综合三种评价指标的综合效果。这个参数是三种评价体系的绝对富集得分的乘积。利用此单一参数也证明，Celastrol是最佳的活性化合物。（Note：我们的实验经常遇到用多重因子比较药物活性大小的情况。我们常常会遇到某种化合物对某一个指标特别有效，而对指标较弱的现象。此时利用立体坐标法或者利用算法将不同的指标合并成一个综合参数，更加有利于化合物药效的综合评价。这个方法值得我们学习！）

图4. 综合评价参数和计算结果

为了结果的准确性，作者进一步用下丘脑数据进行评判，得到了相似的结论（结果略）。（Note：值得关注的是，作者在每种组织中，使用两种不同作用机制的药物进行处理，以获得更全面的基因表达谱）

6. 药物药效测定

获得活性分子以后，作者用动物实验对Celastrol的减肥作用进行了验证。实验结果显示，Celastrol显著降低动物血清瘦素水平，在3周后达到正常小鼠水平（图5D）。相应地动物的饮食在第一周显著降低，以后逐渐升高，到3周后与对照鼠相似。同时，动物体重在给药15天内快速降低，随后达到稳定且趋于正常小鼠。Celastrol不影响小鼠的肌肉含量，仅显著降低脂肪含量。同时Celastrol仅对肥胖DIO小鼠有效，对正常小鼠无效。

图5. Celastrol对饮食诱导肥胖鼠的减肥作用

7. 确认Celastrol是瘦素增敏剂

由于ob/ob或db/db小鼠是瘦素缺陷小鼠，因此如果Celastrol仅是瘦素增敏剂，那么它对这两种小鼠应没有任何效果。事实的确如此。

图6. Celastrol对ob/ob和db/db小鼠无效

进一步，为了确认Celastrol是瘦素增敏剂，作者预先用Celastrol处理正常或DIO小鼠，然后给其注射瘦素，事实证明，Celastrol+瘦素的效果要高于瘦素单用。

图7. Celastrol与瘦素联用效果更佳

8. Celastrol增敏瘦素的机制

瘦素是由脂肪组织分泌的，但作用靶点在下丘脑，且STAT3^Tyr705磷酸化是其主要途径。（Note：瘦素由脂肪组织分泌并作用于下丘脑，但作者却在肝组织中进行药物发现，可见对于非局部作用的药物，我们不必拘泥于药物具体在哪个器官起效，牵一发而动全身，具体用哪里对结果的影响并非想象中那样巨大。这一点，真的跟中医思想有些许相似之处！）

在肥胖状态下，注射激素并不能使STAT3磷酸化，而Celastrol却可以。进一步分析下丘脑中POMC、AGRP和NPY的转录水平。发现，Celastrol不影响POMC和NPY表达，却显著提高了AGRP的表达，同时提高了SOCS3的表达。（Note：纳尼！这也叫机制？）

图8. Celastrol对瘦素增敏的潜在机制

9. Celastrol缓解ER应激

小鼠和细胞实验证明，Celastrol可以有效环节ER应激。（Note：机制是啥？）

图9. Celastrol环节下丘脑ER应激

9. Celastrol调节能量平衡

已知瘦素不仅抑制饮食，还能够保持能量消耗。因此，作者推测Celastrol可以提高能量消耗，促使动物以脂肪作为主要的能量来源。

图10. Celastrol对能量代谢的影响

实验结果显示，对于DIO小鼠，Celastrol对夜间小鼠的能量消耗无影响，但显著提高日间能量消耗，表明主要提高了静息状态下的能量消耗。RER值水平显著降低，证实动物主要以脂肪为能量来源。小鼠的日间运动无变化，但夜间的运动减少。这可能是由于动物索食行为减少造成的。对于正常小鼠和Ob/ob小鼠，虽然RER和活动量降低了，但Celastrol也使能量代谢略微降低。对于db/db小鼠，甚至RER和活动量也不再变化。这些结果提示，Celastrol对能量代谢的影响比较复杂。

作者还后续研究了Celastrol对糖代谢的调节作用，发现Celastrol可以改善糖耐量和胰岛素敏感性。

点评：Umut Ozcan教授利用比较基因表达谱方法，通过比较候选化合物与已知功效化合物的表达谱的相似性，获得与已知功效化合物具有相似功效的新化合物。这是一个很有意思的方法，使我们有机会针对介于疾病和靶基因之间的小综合代谢通路进行新药的发现工作。这项工作非常适合用于发现针对中医的“证候”的新型药物，对于中药现代化而言，具有很高的借鉴价值。至于这个工作为什么能够最终发表到Cell上，主要是因为他们首次发现了能够提高瘦素敏感性的活性化合物，为以瘦素增敏为靶点开发新型抗肥胖药物开创了契机，因此具有非常高的医学价值。

文献二、醉茄素A（Withaferin A）是一种新型瘦素增敏剂

Lee J, Liu J, Feng X, Salazar Hernández MA, Mucka P, Ibi D, Choi JW, Ozcan U. Withaferin A is a leptin sensitizer with strong antidiabetic properties in mice. Nat Med. 2016 Sep;22(9):1023-32. doi: 10.1038/nm.4145.

1.      这个工作为什么能够发表到Nat Med上？

作者上一篇工作，通过比较表达谱方法发现了南蛇藤醇（Celastrol）具有瘦素增敏作用，并可以治疗肥胖。这篇工作利用相同的方法，发现了另一种具有瘦素增敏作用的天然产物——醉茄素A（Withaferin A）。两篇论文的所用方法相同，所得结果相似，甚至主要的药效学结果都很一样，那为什么这个工作依然可以发表到Nat Med呢？我也百思不得其解，直到读到作者的一句话，才发现或许就是因为这样一个简单的原因——“我们用这个新颖的方法先后找到了2种有效的化合物，这证明我们的方法是真实可行的，而不仅仅是偶然的，因此完全可以用作药物发现的新平台来使用。”（A major challenge in the validation of such a methodology was to prove that a compound that emerged from these studies serves as a condensed platform for the discovery of new drugs. Indeed, our findings on celastrol led us to discover withaferin A, and we also thereby documented that this system—and the discovery of celastrol—were not just coincidental.）原来这样也行，大牛就是大牛，不服不行！

2.      与上一篇工作的差异点

首先，这个工作选取了20个基因的靶基因群。(吐槽：可能是有经验了，发现20个最被调节的基因就足够了。)

其次，这次化合物库只和celastrol的表达谱进行比较。(吐槽：之前的Cell论文由于是首篇，对方法的可靠性要求很高，所以作者比较了三个系列的表达谱。现在方法已经经过同行评议了，所以只用一个药物表达谱做比较即可。而且，这样也体现出了化合物优化的意味。)

再次，这次使用的是MEF细胞。(吐槽：跟前面的论述一样，天马行空，我行我素，想选哪个就选哪个，就是这么任性！)

最后，他们利用这个方法找到了三个化合物，排第一的是celastrol，而Withaferin A排第三。(吐槽：(1) 两个化合物都是从CMAP库筛到的，难道他们上次没有找到这个化合物？原因为何？是因为细胞变了造成的吗？(2) 醉茄素A是第二接近Celastrol的，那最接近的是哪个？)

3.      比上一篇工作深入的地方

在作用机制方面，上一篇Cell做了大量似是而非的工作，其实等于没有做机理研究。这篇工作进一步探究了两种化合物在下丘脑的作用部位。作者用免疫荧光方法检测了下丘脑弓形核（弧）、腹内侧下丘脑（VMH）和背内侧核下丘脑（DH）中STAT3的磷酸化情况，发现两种化合物主要提高DMH和VMH区域磷酸化水平。

图11. 两种瘦素增敏剂对下丘脑不同部位STAT3磷酸化水平的影响

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