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[转载]差之“埃米”, 谬以千里: 叠氮基团阻碍酶对糖基的结合 - ACS Central Science
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加拿大University of British Columbia大学Stephen G. Withers教授一直致力于解答“是什么使酶成为如此强大的催化剂”这一令人着迷的问题。实验组的研究主要集中在参与糖苷水解与合成的各种酶上，特别是相关的机理。研究的应用范围包括开发新的酶促合成方法以及新的治疗/显影手段。近期，Stephen G. Withers研究组在ACS Cent Sci在线发表关于叠氮基团阻碍酶对糖基的结合的文章（文末附下载地址）。
风靡化学生物界的”点击化学偶联” (Click Chemistry) 以及Bertozzi开拓性的施陶丁格偶联(Staudinger Ligation) 都利用了叠氮基团的纤小体积与特定活性进行生物正交标记。近年来，细胞代谢标记以及通过活性对糖苷水解酶进行蛋白组概况分析等许多研究手段更是广泛地采用糖的叠氮衍生物作为生物探针。然而，叠氮糖上的叠氮基虽小，与其取代的天然结构中的羟基(或氢原子)相比，无论从就体积还是电荷分布而言都大为不同。尽管差异明显，却很少有人认真评估使用叠氮糖得到的实验结果到底在多大程度上可以反映天然底物的代谢情况。
英文原题：Azido Groups Hamper Glycan Acceptance by Carbohydrate Processing Enzymes
通讯作者：StephenG. Withers
作者：Feng Liu (刘峰), Hong-Ming Chen (陈宏明), Zachary Armstrong, and Stephen G. Withers
下载地址：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.1c01172
使用糖苷水解酶作为一个易于表征的模型系统，定量地考察了酶对叠氮基的接纳程度。动力学显示水解酶对叠氮基取代的衍生物接纳很差。这一结果虽然基于水解酶，但叠氮取代基的影响当可推而放诸其他许多生物系统 - 毕竟酶与底物糖的结合，总是要遵循同样的物理学定律。
首先使用7-羟基-4-甲基香豆素-β-D-葡萄糖苷 (GlcMU) 糖环上2-, 3-, 4-和6-位被叠氮基取代的衍生物考察了糖苷水解酶家族1 (GH1) 对叠氮基的接纳。通过底物消耗动力学可以计算出GH1家族谱系树不同分支58个成员各自对上述几种叠氮衍生物的 kcat/KM的百分比值。如图一所示，实验中大部分GH1水解酶(~66%) 对6-位GlcMU叠氮基衍生物的水解活性很低(小于GlcMU的5%)。只有少数 (19%)对6-位叠氮基的接纳差强人意 (活性在天然底物的20%以上)。而这些接纳很可能也只是由于伯碳原子上的取代基有更大的活动自由度。相比之下，GH1家族水解酶对仲碳原子上的叠氮衍生物 (2-, 3-, 4-Az GlcMU) 则基本没有活性。接着又通过元基因组方法把检视范围拓宽到所有对β- 葡萄糖苷有水解活性的家族。对具有相关活性的元基因组子库(891株)的活性研究和统计学分析得也出了一致的结论。以上结果说明，如果没有预先考察叠氮底物与酶的相容性就使用仲碳叠氮衍生物进行活性测试或筛选，结论将失之纰缪。
图1. 2-, 3-, 4-和6-位叠氮衍生物与未修饰GlcMU(设为100%)的 kcat/KM比值(%)。红色柱状图: 2-位叠氮衍生物; 黄色: 3-位; 绿色: 4-位; 蓝色: 6-位。
把焦点从β- 葡萄糖苷移开，转而使用β-乙酰胺基葡萄糖苷(GlcNAcMU)的叠氮衍生物对具有相应活性的元基因组子库的42个克隆进行研究。图二显示绝大部分克隆对仲碳叠氮衍生物(3-, 4-Az GlcNAcMU) 基本没有水解活性(低于天然底物的1%)，而对6-位伯碳叠氮基的接纳程度甚至远差于葡萄糖苷酶(大多低于5%)。最出乎意料的当属在相关研究中常被修饰的2-乙酰胺基: 大多数b-乙酰胺基葡萄糖苷水解酶对2-叠氮乙酰胺基(2-AzAc)衍生物的水解活性还不及GlcNAcMU的1%。
图2. 2-AzAc, 3-Az, 4-Az和6-Az衍生物与未修饰GlcNAcMU(设为100%)的kcat/KM比值(%)。红色柱状图: 2-位衍生物; 黄色: 3-位; 绿色: 4-位; 蓝色: 6-位。
综上所述，选择和使用糖的叠氮衍生物(特别是当叠氮取代在仲碳原子上时)进行检测应慎而又慎，需要不厌其烦地进行对照实验以保证结果的有效性。以代谢标记为例，不同宿主/体系的相关途径上多种酶如果有任何一个无法接纳叠氮取代基都会导致标记的失败。而跟据不同宿主/体系的标记结果推演和对比天然底物的代谢也会因此失去意义。诚然，某些生物途径(如唾液酸转移酶相关系统)对特定位置的叠氮取代基有相当大的容忍度，相关的细胞表面代谢标记实验也因此取得了巨大成功。而除却这些幸运的特例，如果在设计实验时没有本着科学严谨的精神正视和排除取代基的影响，叠氮基与羟基长度的埃米之差，确实可能导致对结果的解读谬以千里。
Stephen G. Withers
Department of Chemistry, University of British Columbia
研究方向：参与糖苷水解与合成的各种酶上，特别是相关的机理。研究的应用范围包括开发新的酶促合成方法以及新的治疗/显影手段。
研究手段：糖类底物和抑制剂合成、酶促动力学分析、分子生物学：克隆、表达、定点突变和定向进化、使用核磁共振进行酶学研究、使用质谱进行酶学研究、使用X-射线衍射晶体学进行酶学研究、高通量筛选
课题组主页: https://withers.chem.ubc.ca
相关论文发表在ACS Central Science上，刘峰为第一作者，Stephen G. Withers 教授为通讯作者。
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ACS Cent. Sci. 2022, ASAP
Publication Date: May 10, 2022
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.1c01172
Copyright © 2022 American Chemical Society
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