博文

[转载]新型细胞实验评估SARS-CoV-2 (Mpro)蛋白酶抑制剂

已有 2133 次阅读 2022-5-18 08:02 |系统分类:论文交流|文章来源:转载

自新冠爆发以来，这百年一遇的传染病造成世界各国无数病亡。虽然各国科学家日以继夜地研发疫苗，目前市面上已经有数十种疫苗，依旧无法超越病毒突变的速度。三年来新冠病毒已经突变无数次，即使疫苗能够有效地避免病毒造成的重症死亡，突发感染仍然造成无数的后遗症。为了防止病毒过度破坏人体生理机能，当务之急是研发出有效的抗病毒药物。时至今日，真正被核准的抗病毒药物只有辉瑞的PAXLOVID。由于SARS-CoV-2传染力相当高而且没有特效药，病毒相关研究只能在特殊批准的实验室 (BSL-3) 才能操作。由于大部分的生物实验室并没有达到BSL3的规格，因次抗病毒药物的测试通常只能做细胞外实验来检测其抑制活性，但是药物能否进入细胞并且有效地达到抗病毒的功能则必须经由细胞实验来测量。为了降低研究条件的要求，美国得克萨斯农工大学Wenshe Ray Liu研究组研发了一个新的方法，利用这个方法，可以简单地利用细胞的荧光讯号来定量药物对病毒蛋白酶 (M^Pro) 的抑制效果，这一蛋白酶是SARS-CoV2的蛋白外壳能够成熟并且组装的重要蛋白酶，如果能够有效抑制M^P^ro就能有效的抑制病毒的复制以达到抗病毒的效果。

简单且快速地测量抗病毒药物于细胞内的活性、专一性的测试药物对SARS-CoV2 M^P^ro抑制性、减少抗病毒药物开发的困难度。

英文原题： Evaluation of SARS-CoV‑2 Main Protease Inhibitors Using a Novel Cell-Based Assay

通讯作者：Henry Ji, Shiqing Xu and Wenshe Ray Liu

作者：Wenyue Cao, Chia-Chuan Dean Cho, Zhi Zachary Geng, Namir Shaabani, Xinyu R. Ma, Erol C. Vatansever, Yugendar R. Alugubelli, Yuying Ma, Sankar P. Chaki, William H. Ellenburg, Kai S. Yang, Yuchen Qiao, Robert Allen, Benjamin W. Neuman

ACS Cent. Sci. 2022, 8, 2, 192–204

Publication Date: Feb. 2, 2022

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.1c00910

大部分的抗病毒药物试验都是直接利用病毒感染的细胞来测试药物活性，但是由于SARS-CoV系列冠状病毒发现时间较短且传染力极强的病毒，这类病毒的药物测试实验只能在BSL3以上的实验室才能操作，而BSL3规格以上的实验室数量稀少而且使用规定相当严格，因此对于SARS-CoV的抗病毒药物开发相当缓慢。另一个测试药物的方法是直接对于病毒复制的必要的酶进行测验，冠状病毒有三个必要的酶:Main protease (M^Pro)、Papain-like protease (PL^Pro) 与RNA dependant RNA polymerase (RdRP)。因为M^Pro能够促进大部分病毒外壳蛋白的成熟，所以目前大部分的药物都是针对M^Pro的抑制性来发展。可惜的是，药物如何进入细胞并有效地抑制M^Pro，与直接用药物抑制M^Pro是不同的机制。如果药物有效进入细胞，那么基本上是不会有抑制效果的。为了能够有效的测试细胞内抑制活性，我们发展了一套技术，这套技术不涉及病毒的感染与复制，因此大部分生物实验室都能够使用，如此能够大幅增加抗病毒药物的试验与发展。

首先我们合成了一个质粒，这个质粒能够稳定地在人类细胞里面表达含有绿色荧光蛋白的融合M^Pro。由于M^Pro对人类细胞毒性相当高，这个融合蛋白的表达量相当低，因此无法观察到细胞的荧光讯号。接着，我们在细胞培养液中加入已知对M^Pro有杰出抑制效果的药物 (MPI8) ，随著药物浓度的增加，细胞的荧光强度也显著的增加，由于只有能够有效进入细胞并且抑制M^Pro的药物才会有高度荧光讯号，因此我们可以利用细胞的荧光强度来定量药物对于细胞内M^Pro的抑制效果。

病毒的感染与复制是一个相当复杂的过程，这牵扯了一系列不同的人类细胞蛋白酶，为了确保我们的方法符合大部分病毒测试的结果，我们也利用药物去测试病毒感染的细胞，我们发现MPI系列药物的病毒测试结果与我们发展的方法有相同的趋势，证实这个方法能够有效的测量药物的抗病毒活性。我们利用这个方法试验了许多抗病毒药物，其中MPI系列药物是我们针对抑制M^Pro而开发的，这一系列药物可以明显看到因为抑制细胞内M^Pro而造成的荧光讯号增加，其中以MPI8最为显著。其它药物虽然有抗病毒的效用，但是只有GC376能够有效抑制细胞内M^Pro的活性。其中11a、boceprevir、ebselen、calpain inhibitor II、calpain inhibitor XII、K777跟bepridil虽然有抗病毒的功能，但利用我们的方法却无法观察到明显的荧光强度增加，代表其抗病毒活性可能作用在病毒复制的其它步骤。这个方法让我们能够直接测量药物对细胞内M^Pro的抑制效果，以减少药物对细胞其他必要酵素的抑制造成的副作用。

我们利用这个方法测试了30种以上的抗病毒药物，相对于直接利用病毒来测试药物活性，这个方法快速且安全。此外，因为这个方法专一性的测量SARS-CoV2 M^Pro的抑制性，所以能够确保药物的抗病毒活性并不是因为抑制细胞内其他酵素活性而达到抗病毒的效用。

相关论文发表在ACS Central Science上。