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作者：小丫   来源： 嘉因

文中有【彩蛋】脑补2016年一篇Science paper作者的心路历程：

MYC regulates the antitumor immune response through CD47 and PD-L1, Science, 2016.

我对PD-L1、CD47感兴趣，想知道它们受哪个转录因子调控。

Fig. S1 A. Two key immune regulatory proteins expressed on the cell surface of tumor cells, CD47 and PD-L1, and the immune cells that recognize them. 

用《他中了国自然，因为最后一周补了这张图》的方法，获得了两个list，list 1 是结合PD-L1启动子的转录因子，list 2 是结合CD47启动子的转录因子，取交集，发现MYC既结合PD-L1又结合CD47，如下图，这样我就把免疫通路跟癌症通路联系起来了！！！

ChIP-seq数据提示：MYC结合在CD47和PD-L1的启动子上

Fig. 2 C. ChIP-seq analysis of MYC binding to the promoter sequence of the genes encoding CD47 and PD-L1 in mouse MYC T-ALL cells. ChIP-sequencing traces were generated from GSE44672. 没错，这套ChIP-seq是已发表的。

有了这么重要的发现，Key Figure就出来了，进而提出假说：

Fig. S17. MYC regulates the immune response against tumor cells via CD47 and PD-L1. Model demonstrating the regulation of immunological checkpoints in MYC-driven tumors. Following MYC inactivation, the expression of CD47 and PD-L1 is reduced, leading to an immune response and the subsequent induction of senescence and shutdown of angiogenesis 

接下来，怎样设计方案，圆这个故事呢？

套路：

1. 先用《他中了国自然，因为最后一周补了这张图》找到关键调控关系；作为文章的第二部分的Key Figure；

2. 用R2 platform或TCGA的RNA-seq数据证实转录因子-靶基因的表达相关性《TCGA，她已经用了七年 | 资深用户深度点评》；补RT-qPCR和Western blot实验，从RNA和蛋白质水平证实转录因子对靶基因的调控作用；作为文章的第一部分；

3. 有了上面两个方面的研究基础，你就相当有信心，确定转录因子直接调控了靶基因的转录。老板会非常乐意花钱做ChIP-seq或ChIP-qPCR，探索更多处理条件或发育阶段结合关系/强度的变化；作为文章的第三部分；
   

4. 细胞实验、小鼠实验探讨转录因子和靶基因的功能；作为文章的第四部分；

众多5分文章做了第2和第4步，加上第1和第3步，立刻给你的文章加5分。

如何实现？

1. 哪个转录因子调控我的基因？嘉因表观小助手帮你实现，72h交付结果，微信ID：epigenomics；

2. 基因表达相关性分析，跟着嘉因公众号的帖子学着做；

3. ChIP-seq，从ChIP实验、测序到多种数据整合分析和挖掘，嘉因生物帮你实现；
   

4. 常规细胞生物学和分子生物学实验，包括细胞培养、过表达和敲降、肿瘤生长实验、小动物成像分析、RNA提取和RT-qPCR、流式分析、免疫组化；如果这些你也做不了，让我想想；
   

5. 转基因和基因敲除细胞、小鼠，模式生物平台帮你实现。

下面详细解读，跟作者学学实验方案的设计：

第一部分：用最简单的实验初步证实靶基因被MYC调控

（shRNA knockdown MYC，RT-qPCR，R2 platform）

先借助Tet-off白血病转基因小鼠模型，可以人为控制MYC表达或不表达（ON或者OFF）。用RT-qPCR，证实MYC调控了CD47和PDL1的表达。

Fig. 1. MYC regulates the expression of CD47 and PD-L1 in murine and human leukemia and lymphomas 

白血病是这样，实体瘤里什么情况呢？

1. 先看Tet-off肝癌转基因小鼠模型，没有Tet-off模型也没关系，用shRNA knockdown MYC或抑制剂处理的人肝癌细胞系HepG2、melanoma SKMEL28、非小细胞肺癌H1299，用RT-qPCR和流式分选的方法，证实了MYC对CD47和PDL1表达的影响。Fig.2 A-B

2. 用R2 platform挖掘已发表的human primary tumors基因表达数据。发现人HCC、肾癌、结肠癌中MYC与CD47和PD-L1的表达显著相关。

小丫想：用TCGA的RNA-seq数据也能得出相似的结论。可是，当我看到这句：R2 contains mRNA gene expression profiles for more than 70.000 individual human samples，TCGA也要自惭形秽了。R2是个超级强大的平台，不仅数据超级多，还能直接在线挖掘和可视化，由下图可见一斑，长按，识别二维码，直达R2网站。这是这篇Science paper里隐藏的【彩蛋】！

结论：

1. 多种人类癌症类型里，MYC都调控了CD47和PD-L1的表达。

2. 在小鼠肿瘤和人肿瘤细胞中，抑制MYC会导致CD47和PD-L1的mRNA和蛋白质水平降低。

Fig. 2. MYC regulates CD47 and PD-L1 expression in human and mouse tumors and binds to the promoters of the corresponding genes. 

第二部分：用公共数据证实MYC结合靶基因

（ChIP-seq）

用RNA-seq或RT-qPCR看到了调控关系，直接调控？间接调控？傻傻分不清，要做ChIP才能in vivo证实直接结合。

别上来就自己做ChIP-seq，先查已发表的数据能不能用，这里有方法《转录因子调控了谁？挖全天下所有高通量实验数据，只为您解决这一个问题》。找到了2014年发表的两篇文章产生的MYC ChIP-seq数据：Activation and repression by oncogenic MYC shape tumour-specific gene expression profiles. Nature 2014 Jul 24;511(7510):483-7. PMID: 25043018；和BIM is the primary mediator of MYC-induced apoptosis in multiple solid tissues. Cell Rep 2014 Sep 11;8(5):1347-53. PMID: 25176652

查看PD-L1和CD47、CD25等基因启动子区域的结合信号，画出开篇那个神图Fig. 2 C和Fig. S7 and S8。MYC对靶基因的调控有dosage-dependent specific effects。T-ALL和B cell line P493-6，MYC在CD47和PD-L1的启动子上有很强的结合信号，而在CD8a和CD25等基因的启动子上结合信号较弱。 

结论：MYC直接结合CD47和PD-L1的启动子。

第三部分：in vivo，小鼠实验

作者2010年发现MYC inactivation in mouse tumor models results in recruitment of immune cells to the tumors。CD47和PD-L1在这一过程中起到什么作用呢？

结论：

1. 小鼠肿瘤中MYC的失活导致CD47和PD-L1下调表达，增强了抗肿瘤免疫应答。

2. 在强制表达CD47和PD-L1的肿瘤里，MYC的失活会抑制免疫应答，肿瘤继续生长。

3. MYC通过调控免疫调控分子来起始并维持了肿瘤发生。
   

Fig. 3. Constitutive expression of CD47 and PD-L1 in mouse MYC T-ALL 4188 cells prevents recruitment of immune effectors after MYC inactivation. 

Fig. 4. Down-regulation of CD47 or PD-L1 is required for tumor regression, shutdown of angiogenesis, and induction of senescence upon MYC inactivation.

扩展阅读：

PD-L1发现者陈列平教授谈肿瘤免疫治疗 | CSCO2017年会感受

最后分享生物通对这篇paper的介绍，节选自http://www.ebiotrade.com/newsf/2016-3/2016310102749212.htm

这一研究发现第一次将肿瘤发生发展中的两个关键步骤：失控的细胞生长与能够瞒骗意图阻止它的免疫分子联系到了一起。当Myc突变或失调控时，可导致促进细胞分裂的蛋白质水平升高。

“不要吃我”与“别找我”

其中的一个分子是CD47蛋白，斯坦福大学Irving Weissman博士实验室的研究人员曾发现它作为“别吃我”信号，挡开了吞食癌症的免疫细胞——巨噬细胞。几乎所有人类癌症细胞都在其表面表达高水平的CD47，当前有一种CD47蛋白靶向性抗体已进入1期临床试验治疗各种人类癌症。

另外一个分子是称作为PD-L1的“别找我”蛋白，已知在癌症及免疫疾病过程中PD-L1抑制了免疫系统，但它也存在于正常妊娠过程中。PD-L1常在人类肿瘤细胞表面过表达。一种结合PD-L1的抗体已获得美国食品和药物管理局批准用于治疗膀胱癌的非小细胞肺癌，研究证实它可以有效地治疗许多癌症。

在癌症中，Myc是嫌疑犯

十多年来Felsher实验室的研究人员一直从事Myc蛋白研究。Myc是由癌基因编码。癌基因通常履行一些至关重要的细胞功能，当发生突变或错误表达时它们会变成强大的癌症促进者。在一半以上的人类癌症中都存在Myc癌基因突变或失调控。

尤其是，Felsher实验室一直在研究一种称作为癌基因成瘾的现象——它是指肿瘤细胞完全依赖于癌基因的表达。在这些情况下阻断Myc基因的表达，可使得动物体内的肿瘤完全消退。

在2010年，Felsher和同事们证实这种消退现象只发生在免疫健全的动物中，但却不清楚其原因。

关闭Myc的表达

Casey和Felsher决定看看，Myc表达与癌细胞表面CD47 和PD-L1蛋白水平之间是否存在关联。为此，他们调查了当关闭小鼠或人类肿瘤细胞中的Myc表达时发生的事情。他们发现Myc下降导致了小鼠和人类急性淋巴细胞白血病细胞、小鼠和人类肝癌细胞、人类皮肤癌细胞及人类非小细胞肺癌细胞表面CD47和PD-L1蛋白水平类似地下降。

在来自成百上千患者公开的肿瘤样本基因表达数据中，他们发现了Myc表达水平与肝脏、肾脏和大肠癌中CD47和PD-L1基因的表达水平密切相关。

随后研究人员直接检测了D47和PD-L1基因的调控区域。他们发现高水平的Myc蛋白直接结合了小鼠白血病细胞及人类骨癌细胞系中D47和PD-L1的启动子区域。他们还证实这种结合提高了人类血细胞系中的CD47基因表达。

可能的治疗协同作用

最后，Casey和Felsher改造小鼠白血病细胞不管Myc的表达状态持续表达CD47或PD-L1基因。相比对照细胞，这些细胞能够更好地躲避巨噬细胞和T细胞一类免疫细胞的检测，但不同于Felsher实验室以往的实验，当失活Myc表达时这些细胞生成的肿瘤并没有消退。

Felsher说，研究表明，组合靶向Myc和CD47或PD-L1的治疗方法有可能通过减慢或终止肿瘤生长，并向免疫系统挥舞红旗来产生协同效应。