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作者：小丫  来源：嘉因

国自然倒计时1个月，想挖机制，还想加个图，体现工作量，显得基础扎实，怎么办？

比如说基因已经做了功能研究，需要挖机制，完善故事；再比如说lncRNA KO/KD已经看出表型，可是找它调控了谁太难了。那咱换个思路，往上找，找它受哪个转录因子调控，参与哪个明星通路。

这种图既能讲机制，又能在短时间内画出来：

c-fos基因附近有多个enhancer，CBP、RNAPII、NPAS4结合在enhancer上，其结合强度跟细胞膜极性呈负相关。

出自例文一 Nature 2010

Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers

Greenberg Michael E., Kreiman Gabriel, Worley Paul F., Bito Haruhiko, Kuhl Dietmar, Markenscoff-Papadimitriou Eirene, Kuersten Scott, Barbara-Haley Kellie, Laptewicz Mike, Harmin David A., Wu Jing, Bear Daniel M., Costa Allen M., Gray Jesse M., Hemberg Martin and Kim Tae-Kyung

这种图能回答什么问题？

《哪个蛋白质调控我感兴趣的基因？》一文的Plan A，最后画的就是这样的结果图。它能回答七个问题：

1. 您感兴趣的基因附近有哪些调控因子？

2. 转录起始位点在哪？

3. promoter在哪？

4. enhancer在哪？

5. 哪个enhancer最有可能调控我的基因？

6. 哪些转录因子在promoter区调控转录？

7. 哪些转录因子在enhancer区调控转录？
   

这种图能揭示什么机制？

1. 基因附近多个位置有DNase/ATAC-seq的峰，推测这些位置有调控蛋白结合；

2. 用H3K4me3和PolII的峰推测基因转录起始位点TSS的位置；

3. TSS附近有转录因子ABC的峰，推测转录因子ABC结合在promoter，从而参与了基因X的转录调控；
   

4. 用H3K27ac、EP300的峰推测基因附近存在enhancer；

5. 用基因两侧CTCF的峰推测这一区域内enhancer上的转录因子参与调控基因X的可能性更大；

6. Enhancer上有转录因子DEF的峰，推测转录因子DEF参与基因X的远距离调控。

这些调控因子的功能、它们在全基因组范围的分布规律，可回复“TF2”，用factorbook查看。

暂时不补实验，怎样完善故事？

1. 表达相关性分析和生存分析，推测转录因子ABCDEF和基因X的原癌/抑癌作用，推测转录因子ABCDEF对基因的调控作用是激活/抑制，参考《TCGA，她已经用了七年 | 资深用户深度点评》

2. 查文献，转录因子ABCDEF在某癌症中的功能、参与的pathway，最好能跟明星分子或明星通路联系起来，参考《国自然、毕业论文、遗传咨询一站搞定 | 最全的研究进展COREMINE》

怎样开展下一步实验

1. 不同处理条件下转录因子ABC的结合强度变化；

前面用别人的ChIP-seq发现了转录因子ABC结合在基因X附近，下面自己做ChIP-qPCR，查看多种treatment条件下转录因子ABC的结合强度变化，例如野生型和突变型的对比，药物处理前后的对比。

例文二 PLoS Genetics 2010

GC-Rich Sequence Elements Recruit PRC2 in Mammalian ES Cells

Madhani Hiten D., Bernstein Bradley E., Ku Manching, Chi Andrew S., Issac Biju, Zhou Vicky W., Truong Thanh, Koche Richard P. and Mendenhall Eric M.

2. 转录因子AB对同一通路其他重要基因的调控；

前面发现了基因X上游有转录因子ABCDEF结合，推测他们调控了基因X的转录。接下来通过查文献，选两个重要的转录因子AB做ChIP-seq，同时结合motif分析，找到同一通路中，也被转录因子AB调控的其他重要基因，一起讲个Big story。

例文三 Nature 2012

Regulation of Circadian Behavior and Metabolism by Rev-erbα and Rev-erbβ

Evans Ronald M., Panda Satchidananda, Downes Michael, Auwerx Johan, Liddle Christopher, Glass Christopher K., Atkins Annette R., DiTacchio Luciano, Chong Ling-Wa, Lam Michael T., Barish Grant D., Yu Ruth T., Hatori Megumi, Zhao Xuan and Cho Han

3. 位于enhancer区域的转录因子DEF对基因X的远距离调控的验证；

发现了enhancer，也找到enhancer上结合了哪些TF，就要问：这个enhancer调控的是基因X吗？用3C实验验证enhancer调控了基因X。

例文四 Nature 2010

Mediator and Cohesin Connect Gene Expression and Chromatin Architecture

Young Richard A., Dekker Job, Taatjes Dylan J., Levine Stuart S., Rahl Peter B., Goossens Jesse, Ebmeier Christopher C., van Berkum Nynke L., Orlando David A., Zhan Ye, Bilodeau Steve, Newman Jamie J. and Kagey Michael H.

怎么画这图？

看过1-6步，就能画出这样的神图：

1. 原理

2. 在线快速查看结果

3. 局限性

4. 速查表

5. 从哪里下载数据
   

6. 怎样批量处理数据

7. 怎样展示结果

《Plan A详细步骤1234》详细描述了1234；

《Plan A详细步骤56》详细描述了56；

本文解答了第7步。

小丫画的图长啥样？

例文五 Nature biotechnology 2010

Transcript assembly and abundance estimation from RNA-Seq reveals thousands of new transcripts and switching among isoforms

Pachter Lior, Wold Barbara J., Salzberg Steven L., van Baren Marijke J., Kwan Gordon, Mortazavi Ali, Pertea Geo, Williams Brian A. and Trapnell Cole

作者认为Fhl3有个新的isoform（黄色），位于RefSeq isoform（蓝色）的第一个intron里。TAF1和PolII ChIP-seq的峰支持了Fhl3的这个新的转录起始位点（TSS）。

没错，这个方法还能帮你鉴定lncRNA转录起始位点。

Figure 3. Excluding isoforms discovered by Cufflinks from the transcript abundance estimation impacts the abundance estimates of known isoforms, in some cases by orders of magnitude. Four-and-a-half-LIM domains 3 (Fhl3) inhibits myogenesis by binding MyoD and attenuating its transcriptional activity. (a) The C2C12 transcriptome contains a novel isoform that is dominant during proliferation. The new TSS for Fhl3 is supported by proximal TAF1 and RNA polymerase II ChIP-Seq peaks.

Paper里用的是Mouse skeletal muscle C2C12 cells，小丫好奇人的同源基因是不是也有个新的isoform，刚好手里有所有已发表的人Fetal Liver的ChIP-seq数据，找出哪些转录因子结合在FHL3附近，画出了下面这个图：

位于屏幕中间那个基因就是FHL3，参考基因组上认为它的转录起始位点TSS位于第一个黑框里，然而我们看到第2和第3个黑框里也有PolII的结合信号，难道这里也有两个新的isoform？另外，GATA1、NFE2和TAL1在相同的位置也有很强的结合信号，这里一定有故事。

本文这些例文都是用《找到了motif，怎样展示结果？》介绍的工具找到的，文章有点老。明天找找新paper，再跟大家分享。