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作者：小丫  来源：嘉因

去年6月，小丫写了这篇帖子，吸引了好多小伙伴儿用这套方法做验证，有了困惑通过销售转告给小丫，小丫解答的很开心~ ~ ~

现在重新整理一下帖子，力求描述的更清晰，希望能更方便的帮助更多的小伙伴儿 ~

做了miRNA-seq，找到差异表达miRNA后，要做验证，Taqman探针好贵，LNA也没便宜多少~

我要做的miRNA不在商品化的探针目录里，需要定制，贵，时间还长~

有什么高效且经济的方法吗？

小丫今天推荐带接头的引物+SybrGreen染料法：

一步完成加polyA尾巴和反转录；

用miRprimer软件设计基因特异的上下游引物，用SybrGreen做qPCR。

溶解曲线漂亮，Ct值20出头，跟miRNA-seq趋势一致；

小丫的小伙伴儿亲测，人、小鼠、果蝇，都有效。

原理一目了然：

第一步：设计基因特异引物：

小丫喜欢把该物种的所有miRNA都设计出来，需要做哪个基因，把相应的引物复制出来就好。

1. 到miRBase下载该物种的所有miRNA序列：

进入http://www.mirbase.org，点击Browse；

Expand all，点击你要的物种的拉丁名；

进入这个页面：

在最下方，选择Mature sequence，点击select all，点击Fetch Sequences，就获得了该物种的所有miRNA成熟体序列。

复制，粘贴到一个文本文件中，一定要扩展名是txt的那种最简单的文本文件，文件名一定要叫input_miRs.txt。

2. 进入https://sourceforge.net/projects/mirprimer，下载miRprimer，把这7个文件都下载到同一个文件夹，给文件夹取个名字叫miRprimer。

把第一步获得的input_miRs.txt文件也放入miRprimer文件夹中。它一次最多计算25个miRNA的引物，所以，如果你的miRNA列表超过25个，需要分多次放入imput_miRs.txt文件当中。

注：文件名只能是input_miRs.txt，否则这个软件不认识~~

在Windows系统下双击miRprimer2.exe，会有个黑色窗口闪过，没错，就是闪过，然后发现多出来5个文件，就是结果。不用设置任何参数，不用输入任何命令。

所有的引物对都在result_all_primer_pairs.txt文件里，相邻的两行是一对引物，例如，F_3和R_2是第一对引物，F_2和R_2是第二对引物。

刚开始为了节约时间，小丫给每个miRNA合成了2对引物。

2对引物可能只有3条，而不是4条，因为共用了一条下游引物R_2。

检测溶解曲线是否干净，查看Ct值是否太大。保留一个溶解曲线干净，Ct值低的做样品的qPCR。

亲测20个miRNA，往往是第一对引物就很好用，溶解曲线很干净，Ct值介于20-30之间。

有个别miRNA的两对引物都有双峰，又合成了第三对引物，还是有双峰，这样的miRNA就得换实验方法了。

所以，推荐的策略是：每个miRNA先合成一对引物，如果不好用，再合成第2、3对引物，再不好用，换实验方法。

最好的一对都给整理好了，在result_best_primer_pairs.txt文件里：

拿这对引物做qPCR，文章作者的成功率也很高：

第二步：合成通用的反转录引物和基因特异引物。

反转录引物序列：5’-CAGGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTVN, where V is A, C and G and N is A, C, G and T.  

引物合成订单表如下：

连同第一步获得的基因特异引物一起送公司合成，PAGE级别。

第三步：加polyA和反转录

反应体系如下：

1ul 10X polyA polymerase buffer（NEB, M0276S）

1ul 1mM ATP（20ul 10mM + 180ul H2O）

1ul 10uM RT-primer

1ul 1mM dNTP（NEB, N0447S, 20ul 10mM + 180ul H2O）

0.5ul 200U/ul SuperScript® III Reverse Transcriptase（Invitrogen, 18080093）

0.2ul 100U/200ul polyA polymerase （NEB, M0276S）

10pg to 100 ng RNA sample

complete with RNase-free water up to 10ul.

反应条件如下：

42C, 1h；95C, 5min

稀释：

4 ~ 8 X，分装，-20C冻存。

注：RNA的量一定要按照要求控制好，10ul体系10pg to 100 ng RNA sample，不要贪多。

总RNA里miRNA的比例的确很低，所幸Invitrogen的SuperScript® III Reverse Transcriptase反转录效率很高。如果RNA加的太多，反而降低反转录效率，得不偿失，切记！！

第四步，RT-qPCR

反应体系：

10ul SybrGreen Master Mix（Roche, 4913914001）

9ul primer（50ul 2uM Forward primer + 50ul 2uM Reverse primer + 900ul H2O）

1ul cDNA

反应条件：

95C, 5min;

95C, 15s; 60C, 30s; 40 cycles

95C, 15s;

60C, 30s;

4C, 1h

仪器：ABI StepOnePlus，用机器默认的溶解曲线程序。

注：原文使用的反转录酶是NEB的MuLV，亲测1/3的miRNA的Ct值超过了30，改用Invitrogen的SuperScript® III Reverse Transcriptase，所有miRNA的Ct值降至20出头。

所以推荐使用反转录效率高的SSIII，价格贵一半，效率高2的n次方。

该方法出自文献：

方法：doi:10.1186/1471-2105-15-29

软件：doi:10.1186/1472-6750-11-70

protocol：10.1007/978-1-4939-1062-5_7

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