精确代谢组学方法助力揭示衰老的代谢特征多样性

由于内源性代谢水平的波动直接反映了生理和病理表型，代谢组学开始得到前所未有的重视！代谢组学入门门槛低，但要做好却不易！数据分析时极易出现代谢物结构鉴定错误的问题，有些代谢组学数据报告中代谢物鉴定错误的比例高得会令人惊讶！我们还经常会遇到“测到了2000乃至3000种代谢物”的描述，似乎测到的代谢物数量能反映出研究水平，殊不知里面的代谢物鉴定可能错误百出，由此得出的结论自然无法取信，这也极不利于代谢组学技术的发展与推广！

尽管目前针对不同类型代谢物开发了各种基于质谱技术的分析方法，但困扰分析精度和结构鉴定的技术问题仍然存在，这在血浆代谢组分析方面尤为突出，因为血浆代谢组化学性质各异以及复杂的基质会显著减低代谢物定性与定量结果的准确性。此外，与基因组学和蛋白质组学提供的基因/蛋白质数量信息相比，代谢组学分析提供的代谢物数量信息较少，这在一定程度上限制了代谢组学的应用。为了克服这些瓶颈问题，迫切需要开发新方法来提高代谢物覆盖度和分析精度。已有的大量有关研究主要集中在增加代谢组覆盖度上，但对提高分析准确性的关注相对较少。

近日，我们在《Small Methods》（IF: 14.2）发表了题为“Precise metabolomics reveals a diversity of aging-associated metabolic features”的研究论文，开发了一种精确定量代谢组学分析方法，该方法首次大规模使用同位素内标对血浆中的主要极性代谢物进行了精准定量与精确定量相结合、代谢物扩展定性鉴定，大大增加了代谢组学数据的可靠性和分析精确度，并成功应用于人类衰老相关的血浆代谢特征研究。

      研究人员引入覆盖人体主要代谢通路的64种同位素内标（ISs），校准代谢组数据。选择ISs进行校准的匹配规则遵循最小变异系数（COV）的主要标准。质控样本（QC）中，如果代谢物经特定ISs校准后获得的最小COV都在5%窗口内，则根据结构相似性和保留时间的接近的原则进一步筛选ISs。实验设计见图一。

图一. 实验设计

通过引入和精确选择合适的ISs校准代谢组数据，QC样品中所鉴定的480种代谢物的COV从14.3%降低至9.8%（图二）。同时，对于未知代谢物的鉴定，根据其匹配的最佳ISs结构和保留时间，有助于其准确定性。

图二. ISs校正前后QC样品中已鉴定代谢物变异系数（COV）的比较

研究人员应用建立的精确代谢组分析方法探究了225名年龄在20-88岁受试者的血浆代谢组图谱，来阐明人类衰老过程中的系统代谢特征和通路的变化。

逻辑回归分析血浆代谢组与年龄之间的相关性的结果如图三所示，色氨酸2-C-甘露糖苷、苯丙氨酸天冬氨酸、琥珀酰腺苷、3,3'-硫代双丙酸和瓜氨酸表现出与年龄呈显著正相关。主要的类固醇硫酸盐，如硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）、硫酸孕烯酮（PregS），雄甾酮葡萄糖醛酸（AG）等与年龄呈显著负相关。在与衰老最显著相关的前十种代谢物中，七种代谢物是类固醇衍生物，其中六种是类固醇硫酸盐。

相关性分析或差异相关性网络分析提供了在给定生物学背景下发现功能性代谢物模块的线索。年轻（20-41 岁）和老年（60-81 岁）组之间代谢物相关性的弦图显示，类固醇和其他代谢物之间的特定相关性在老年组中完全消失。在老年组中，溶血磷脂酰胆碱（LPCs）与酰基肉碱、LPCs与氨基酸的正共调控作用消失或减弱，一些脂肪酸在年轻组中没有表现出显著的代谢物-代谢物相关性，而在老年组中显示与氨基酸呈负相关。

图三. 与衰老相关的代谢特征

图四显示了与年龄正相关的血浆代谢物，包括色氨酸2-C-甘露糖苷、泛酸、胆碱、三甲胺N-氧化物（TMAO）、以及与精氨酸代谢、氨基酸代谢和嘌呤代谢相关的代谢物。

图四. 极性代谢物与衰老显著正相关

多尺度嵌入相关网络分析（MECNA）进一步说明了年轻组和老年组中各种代谢物之间的差异相关性，这表明各种代谢物（包括类固醇、脂质、葡萄糖和氨基酸）之间的相关性存在与衰老相关的干扰（图五）。AG是血浆代谢物MECNA分析的中心枢纽，此外，葡萄糖酸是全局MECNA网络中确定的另一个重要枢纽，与许多极性代谢物呈正相关，包括修饰的氨基酸和一些二肽。此外，MECNA分析还表明，年轻组和老年组的各种脂肪酸（棕色结节）之间存在显著差异相关性。

图五. 多尺度嵌入相关网络分析（MECNA）

人类血浆DHEA水平与年龄显著相关，在20多岁或30岁出头时浓度最高，然后随着年龄的增长逐渐下降。同样，随着年龄的增长，PregS和其他一些类固醇的水平也呈现出下降趋势（图六）。这些结果表明，类固醇和激素是人类衰老过程中变化最为广泛的代谢途径。基于从MECNA结果中选择的类固醇，研究人员进一步发现，在老年组中，TCA循环、胰高血糖素信号通路和中心碳代谢与这些类固醇显著正相关。

图六. 类固醇衍生物代谢产物与衰老显著正相关

逻辑回归分析表明，大多数游离脂肪酸（C16、C18、C20和C22）和不同酰基链长度的酰基肉碱与衰老呈现显著正相关（图七略）。

小结一下，该项研究建立了精确代谢组学分析方法，大大提高了定性和定量的准确性。该分析方法应用于中国衰老人群的血浆代谢组的分析，结果系统揭示了人类衰老过程中血浆中多种与衰老相关的代谢特征，包括类固醇代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、嘌呤代谢和尿素循环，这使我们能够得出与各种年龄相关疾病病理学的相关信息，为预防和治疗这些与年龄有关的疾病提供了线索。